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1.4.1疫苗开发 8
1.4.2蛋白质文库与肽文库的筛选 8
1.4.3全细胞催化剂 8
1.4.4其他应用 9
1.5存在的问题及展望 9
1.5.1透明质酸酶相关问题 9
1.5.2细菌表面展示技术的局限性 9
1.6本课题的研究目的和意义 10
1.6.1研究的目的 10
1.6.2研究的意义 10
2实验材料与仪器设备 11
2.1实验材料 11
2.1.1菌株和质粒 11
2.1.2培养基及其制备 12
2.1.3主要生物学试剂 13
2.1.4质粒、总DNA提取，质粒转化所需试剂 13
2.1.5琼脂糖凝胶电泳所需试剂 13
2.1.6蛋白质的SDS-PAGE电泳所需试剂 13
2.1.7材料及来源 14
2.2主要仪器和设备 15
3实验操作方法 15
3.1菌种活化（马疫链球菌ATCC43079) 15
3.2 DNA相关操作 15
3.2.1 马疫链球菌细菌基因组提取 15
3.2.2 大肠杆菌质粒的提取 16
3.2.3 PCR扩增目的基因片段 17
3.2.4将目的基因连接到载体上 18
3.3重组质粒的转化和转化子的筛选鉴定 19
3.3.1将连接好目的基因的载体转入大肠杆菌 19
3.3.2大肠杆菌转化子的筛选鉴定 20
3.3.3回收目的片段、酶切验证 21
3.3.4转化入大肠杆菌BL21菌株，并验证连接效果 22
3.4通过NCBI进行序列同源性比对 22
3.5验证构建好的载体的表达情况 22
3.5.1聚丙烯酰胺凝胶电泳验证(蛋白质的SDS-PAGE电泳) 22
4结果与分析 25
4.1马疫链球菌透明质酸酶基因的抽提及扩增 25
4.2 PMD18-T-HAase重组质粒的构建 25
4.3 连接效果验证 26
4.4重组质粒的验证 27
4.5 HAase表面展示重组质粒的构建 27
4.5.1连接，转化，菌落筛选 28
4.5.2质粒抽提及电泳验证 28
4.5.3酶切验证 29
4.6同源性比对验证 30
4.7融合蛋白InaQ-N-HAase的表达 30
5讨论 30
5.1 pMD18-T载体使用过程中应注意的地方 30
5.2酶切过程遇到的问题分析 31
5.3提取质粒过程中遇到的问题 31
5.4琼脂糖凝胶电泳出现的问题分析与讨论 32
5.5 SDS-PAGE注意事项 32
6结论 32
7致谢 33
8参考文献 34
1 前言
1.1 透明质酸酶的概述
透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）又称为玻璃酸酶，是对催化降解透明质酸酶的通称。两项研究导致了透明质酸酶的发现，一是1928年Duran．Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。二是1937年Meyer发现Ⅱ型肺炎链球菌可降解透明质酸(hyaluronic acid，HA)[2]。随后，前面提到的“扩散因子” 也被鉴定是透明质酸酶。此后，人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透明质酸酶。在人体组织及体液中也发现广泛存在着透明质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。透明质酸酶分布虽广，但在过去很长一段时间里由于分离纯化困难而且似乎研究意义不大，并没有得到很好地研究，是一类被忽视的酶。最近十几年来，人们对HA和透明质酸酶显示出了浓厚的兴趣，试图探求它们在众多生物学过程中的作用。