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    摘要：利用本实验室前期研究筛选到两株可诱导的P2-Like溶源噬菌体P88和Pro147，尝试对噬菌体宿主谱进行改造试验。分析发现了P88尾丝蛋白氨基酸序列高变区716-746为关键宿主谱决定区，其中具有多个有差异的氨基酸位点。本研究选取了其中五个（SA、SF、SG、SH、SJ）位点利用同源重组的方法，对此2株噬菌体的尾丝蛋白的结构进行替换改造，将噬菌体P88尾丝蛋白特定氨基酸位点替换为噬菌体Pro147相应位点，以期改变其原有宿主谱。对重组前噬菌体进行诱导及筛选后，发现噬菌体P88的宿主谱发生了一定的改变。本实验结果表明，溶源性噬菌体P88的尾丝蛋白结构决定了其宿主谱的特异性；其中关键的氨基酸位点的替换可直接改变P88的宿主谱。25655
    毕业论文关键词：前噬菌体；同源重组；宿主谱改造
    Transformation of host range of Escherichia coli Inducible prophage
    Abstract:In order to reconstruct the host range of Escherichia coli phage,We screened two strains of inducible P2-Like coliphages P88 and Pro147 in our laboratory.In our analysis, the P88 filament protein amino acid sequence hypervariable region 716-746 was found to be the critical host determinant region.The reserach selects five amino acids sites (SA, SF, SG, SH, SJ), reconstructed the structure of the tail protein of this two phages and replaced the specific amino acid site of the phage P88 tail protein.After induction and screening of recombinant phage, we found that the host spectrum of phage P88 has changed.The results showed that the structure of the tail protein of the phage P88 determined the specificity of its host range, and the change of the key amino acid site could directly change the host range of P88.
    Key words:prophage; homologous recombination; expand the host range
    目  录
    摘要1
    关键词1
    Abstract1
    Key words 1
    引言1
    1材料与方法2
    1.1菌株和质粒2
    1.2培养基和主要试剂  2
    1.3主要仪器  3
    1.4研究方法3
    1.4.1噬菌体的分离、纯化及增殖3
    1.4.2噬菌体基因组和细菌基因组的提取3
    1.4.3噬菌体基因组和细菌基因组的测定和拼接4
    1.4.4尾丝蛋白的序列分析比对4
    1.4.5引物设计4
    1.4.6同源重组片段制备5
    1.4.7含pKD46质粒的大肠杆菌感受态制备及电转化5
    1.4.8含pWRG99质粒的大肠杆菌感受态制备及电转化 6
    1.4.9噬菌体P88改造株诱导及宿主谱测定6
    2结果与分析6
    2.1尾丝蛋白的序列对比  6
    2.2噬菌体P88尾丝蛋白关键氨基酸位点替换  7
    2.3噬菌体P88改造株诱导及宿主谱测  8
    3讨论  9
    致谢 10
    参考文献 10
    大肠杆菌可诱导性前噬菌体宿主谱改造试验 引言：噬菌体在二十世纪早期由Fredrick Twort和Felix D’Herelle分别在1915和1917年发现，其广泛分布于自然环境中，是一种可感染细菌、螺旋体、放线菌、支原体、蓝细菌等多种细菌的病毒。[1]根据其与寄主菌的关系大概可以分为烈性噬菌体和溶源性噬菌体两种。其中某些噬菌体侵入寄主细胞后，将其基因整合于细菌的基因组或质粒的中，在细菌DNA复制分裂过程中同时复制，不形成病毒粒子，不裂解细菌，这种噬菌体叫温和噬菌体或溶原噬菌体，整合到细菌DNA上或以质粒的形式存在的噬菌体基因叫前噬菌体，带有前噬菌体的细菌叫做溶原性细菌。[2]
      自从抗生素被发明以来，就被应用于控制细菌感染。但是随着抗生素在生产生活中被广泛使用，大肠杆菌的耐药性在不断增强，抗生素的效果显著下降。而使用噬菌体治疗细菌感染不易产生不良反应、不易产生抗药性、无残留且成本低，不会破坏体内正常菌群平衡[3-5]，因而，噬菌体有望成为抗生素的替代品应用于临床。在上个世纪的研究中，就已经证明了利用噬菌体可以在一定程度上控制由大肠杆菌引起的犊牛、仔猪和羔羊的腹泻(Smith和tlug．gins，1983；Smith等，1987)。Borrow等(1998)证明，在感染大肠杆菌的鸡体多点肌肉注射抗K1荚膜噬菌体后，可以获得良好的保护率。但是此前的实验仅仅从可行性上对噬菌体治疗大肠杆菌疾病作出了一些探索，所采用的噬菌体仍然是由自然界中分离所得，而从自然界中筛选宿主谱广，裂解能力强的噬菌体是一项复杂的工作，因此，我们可以通过改造现有的噬菌体，增广其宿主谱，强化其裂解能力来获得具有治疗作用的噬菌体。而噬菌体作用于细菌的过程首先依赖于其具有特异性结构的尾丝对细菌外壳的吸附[6]。大肠杆菌作为常用的模式生物,操作方法和平台构建得都相对成熟。在实验室前期的工作中采用ClustalX (version 2.1)比对发现大肠杆菌噬菌体P88和Pro147具有较近的亲缘关系，因此尝试使用Red同源重组的方法对这两株宿主谱不同的噬菌体进行尾丝蛋白的改造，研究其宿主谱和裂解能力的变化，以期为使用噬菌体治疗大肠杆菌感染做出初步的研究。
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