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1.2.2 黄瓜根际土菌体细胞的提取
采用多次匀浆-差速离心法[17]提取根际土中菌体细胞:10 g新鲜土壤用100 ml 0.2% 焦磷酸钠溶液重悬,2,200 rpm匀浆处理60 s 3个循环,间歇冰浴,防止过热。土壤匀浆液加0.2 %焦磷酸钠溶液稀释到500 ml,1,000 g离心10 min,使菌体与土壤初步分离。沉淀重新匀浆60 s,低速离心,重复3次,合并上清,12,000 g离心20 min,弃上清,沉淀用50 ml PBS 缓冲液重悬,即为根际土菌体细胞悬液,4 ℃暂时保存。
1.2.3 生物膜共培养[5]
将过夜活化的菌株SQR9接种于无菌LB液体培养基中,37 °C,170 r*min-1培养至对数生长期,OD600约为1.0。离心收集菌体后,用等体积的MSgg液体培养基重悬菌体。生物膜培养采用24孔细胞培养板,板上放置24孔滤网,在培养孔中加入0.5 ml MSgg培养基,1 ml PBS缓冲液,菌株SQR9悬液20 μl,0.5 ml根际土菌体悬液或0.5 ml PBS缓冲液作对照,于37 ℃静置培养24 h。
1.2.4 提取生物膜和培养液中的DNA
取出24孔滤网,生物膜残留在滤网上,在新的无菌24孔细胞培养板上加2 ml PBS缓冲液,放入24孔滤网洗涤生物膜,去除游离细胞,重复洗涤3次,6个培养孔的生物膜的合为一个生物膜样品,并收集剩余培养液及生物膜洗涤液作为游离细胞样品,分为菌株SQR9生物膜、菌株SQR9加黑土生物膜、菌株SQR9游离细胞、菌株SQR9加黑土游离细胞4个处理,每个处理3个重复。样品用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio)土壤DNA提取试剂盒提DNA。
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