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3.1.3大肠杆菌质粒PTrcHisc-inpN-gfp的转化 14
3.2大肠杆菌细胞表面展示条件的优化 15
3.2.1IPTG浓度对大肠杆菌表面展示效率的影响 15
3.2.2温度对大肠杆菌表面展示效率的影响 17
3.2.3诱导浓度对大肠杆菌表面展示效率的影响 18
4讨论 19
5总结 20
致谢 21
参考文献 22,3780
1前言
1.1 细胞表面展示技术简介
细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白横穿过质膜，以一些以共价或非共价结构与细胞表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜的机理。通过建立在微生物细胞表面展示外源蛋白的系统，可以用来分离多肽；生产生物催化剂，全细胞活性吸附剂和活体疫苗；并且可以筛选异源或者修饰蛋白[1]。
细胞表面展示通常是指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元（anchoring motif）的编码基因融合后，通过融合蛋白在受体细胞中表达、分泌以及与细胞表面特定结构成分之间的识别，所表达的融合蛋白最终固着在宿主细胞的表面，以达到研究或应用的目的。其原理是通过把靶蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序列(定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。常用的载体蛋白有膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素以及S-层蛋白等。外源蛋白与载体蛋白序列的融合方法有C末端融合、N末端融合、插入融合。目前开发应用的微生物细胞表面展示系统包括革兰氏阴性细菌表面展示系统、革兰氏阳性细菌表面展示系统和酵母菌表面展示系统。微生物细胞表面展示技术有着广泛的用途，如开发细胞催化剂、活疫苗、细胞吸附剂、生物传感器以及用于医学诊断、工业、环境保护等的细胞受体等。锚定于细胞表面的外源蛋白可以克服某些大分子底物不能直接穿越细胞膜进入胞内反应位置，以及某些反应产物在胞内无法正确折叠等弊端。细胞表面展示的外源蛋白能与细胞外环境中的特定反应底物直接接触并发生作用，从而大大提高反应效率；同时，通过设计简便的胞外制备流程即可提取反应产物，从而免去某些产物通常不得不从细胞内提取与纯化等一系列复杂低效的操作过程。因此，细菌细胞表面展示在细菌表面多肽文库的构建与筛选，抗原在非致病细菌细胞表面表达，环境中有毒物质的降解、口服疫苗、生物传感器等多方面显示出良好的发展潜力[2]。
细胞表面展示技术是通过一段具有分泌转运功能的蛋白质或多肽与外源蛋白融合表达，然后将外源蛋白转运并锚定于细胞表面而实现外源蛋白的特定功能。一个表面展示体系通常由运载蛋白、乘客蛋白和宿主菌三部分组成。运载蛋白也叫锚定蛋白，负责将外源蛋白分泌转运并锚定到细胞外表面，不同的运载蛋白会对受体菌生理机能产生影响。因此，锚定单元的选择是细胞表面展示体系构建成功与否及性能优劣的关键。用于构建细胞表面展示体系的锚定单元应具备以下特性：(1)具有引导融合蛋白穿过细胞膜的信号肽序列或转运信号；(2)可引导融合蛋白到达细胞表面的特定部位；(3)具有稳定的可与细胞表面特定部位识别的锚定单元，使融合蛋白能固着于细胞表面；(4)与外源蛋白的融合不会改变其本身的稳定性，且不易被细胞内外蛋白酶降解。乘客蛋白即外源功能蛋白，指在细胞内表达，并在运载蛋白的帮助下经过跨膜转运锚定于细胞表面并行使特定功能的蛋白。在表面展示体系中，乘客蛋白的大小通常受到限制。乘客蛋白能影响融合蛋白的跨膜运输，细胞表面定位及最终的展示效果。因此，乘客蛋白的选择直接关系到细胞表面展示体系功能的优劣。好的乘客蛋白除了有合适的大小外，还需注意其折叠形成的二硫键、带电荷基团、疏水性基团等对其跨膜分泌的影响以及功能活性中心不能与融合位点靠得太近等问题。宿主菌则是表面展示体系的支撑载体。选择合适的宿主菌是细菌细胞表面展示成功与否的基础。好的宿主菌不仅需要对表面展示的融合蛋白具有兼容性和较低的蛋白酶降解活性，还需要易于培养，不易裂解。根据展示外源蛋白的不同用途，对宿主菌的生长代谢特性和安全性还有一定的要求[3]。在各种微生物类群中，目前已经建立起多种表面展示系统，如噬菌体展示系统、革兰氏阳性菌表面展示系统、革兰氏阴性菌表面展示系统、酵母表面展示系统和杆状病毒表面展示系统等[4]。