在植物的保护酶系中, 超氧化物歧化酶( SOD) 是主要的活性氧清除酶系, 它催化超氧阴离子发生歧化反应, 生成 H 2O 2和 02 -•, 接着过氧化氢酶( CAT) 可将 H2O2 转化为无害的 H2O 和 O2。另外, 过氧化物酶( POD) 对活性氧的清除也起重要作用 由 SOD 、POD和 CAT 等酶所组成的保护系统控制, 它们的殊功能就是作为氧自由基的清除者,文持细胞内氧自由基的平衡[12]。
A液(0.2mol/L的Na2HPO4;溶液,IL):准确称取71.7克Na2HPO4•12H2O置于5O0mL
烧杯,用少量蒸馏水溶解,移入1000mL容量瓶,用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰
箱中保存备用。
B液(0.2mol/L的NaH2PO4溶液,1L):准确称取31.2克NaH2PO4•2H2O置于500ml
烧杯,用少量蒸馏水溶解,移入1000ml容量中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀。4℃冰箱中保存备用。
选取一定部位草莓果肉1g,于预冷研钵中,加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为10ml,于10000r/min下离心10min,上清液即SOD粗提液
(1)超氧化物歧化酶SOD的测定(氮蓝四唑光化还原法)
准备5支试管(要求透明度好),一支对照,一支空白,按表1加入各溶液,混匀后将空白管置于暗处,其他各管于4000xl日光灯下反应20min[6]。
表1:各溶液加入量
试剂(酶) 用量(ml) 终浓度
0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5
130mm/L甲硫氨酸溶液 0.3 13mmol
750μmol/L氮蓝四唑溶液 0.3 75μmo
100μmol/L EDTA-2Na溶液 0.3 10μmol
100μM核黄素 0.3 2.0μmol
酶液 0.05 空白、对照加缓冲液
蒸馏水 0.25
总体积 3.0
560nm处测量吸光度并代入公式1[6]计算:
ACK —对照烧杯的吸光度值;
AE —为样品的吸光度值;
V —样液总体积;
Vs —为测定时样液用量体积;
0.5 —抑制NBT光化还原的50%;
W —测定的鲜重;
G —SOD总活力单位为u/g。
(2)过氧化物酶POD的测定(愈创木酚法)
试剂1:100mmol/L磷酸缓冲溶液PBS(PH6.0)
试剂2:愈创木酚反应液(50mlPBS和28μl愈创木酚加热搅拌溶解,冷却后加入19μl30%H2O2,冷却后保存于冰箱备用)
取试管4支,一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零,其余作为样品管分别加入3ml反应液,1ml酶液,立即计时,在470nm处测定,每30s读一次,测一加一。
酶活的计算:以每分钟OD的变化(升高)0.01为1个酶活单位(u),见公式2[6]:
KE—OD值增加速率;
V一为样液总体积;
VS—测定时样液用量体积;
W—样本的鲜重。
(3)过氧化氢酶CAT的活性测定
试剂:0.2mol的磷酸缓冲溶液(PH7.0、100ml含1gPVP)
取4支10ml试管,一支空白,三支样品管。体系为3ml,每管0.2ml酶液、1.5ml磷酸缓冲液,1ml蒸馏水(空白管蒸馏水代替酶液),加入酶液后煮沸5分钟,冷却后加入H2O2测定吸光值。25℃预热后加入0.3ml 0.1mol/LH2O2,每加完一管立即计时,迅速倒入石英比色皿中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数一次,共测4min(调零用缓冲溶液)
酶活的计算:以 240nm 吸光值每min 减小0. 1为1个酶活性单位(u),见公式3[6]:
KE—OD值降低速率;
V一为样液总体积;
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