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    摘要：前期研究表明，蜡质芽胞杆菌AR156通过同时激活SA、JA/ET两个信号通路诱导拟南芥及番茄产生系统抗病性，同时伴随着细胞水平上的活性氧迸发、胼胝质沉积和染色质凝集等现象的发生，以及分子水平上的SAR、ISR标志基因的表达。在对AR156诱导系统抗性过程中不同时间点取样并进行高通量测序时，我们发现sly-miR482在AR156处理后表达丰度明显降低，Northern blot检测结果和测序结果一致。因此我们假设sly-miR482在蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物产生系统抗性过程中起着重要的作用。为研究解析sly-miR482在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物系统抗性过程中的作用机制，通过Gateway克隆技术对sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d、sly-miR482e基因进行克隆，后利用农杆菌介导的叶盘转化法，在番茄植株内进行过量表达，获得过表达转基因植株。26208
    毕业论文关键词：蜡质芽胞杆菌，小分子RNA miR482,诱导系统抗性，转基因、番茄
    Overexpression of sly-miR482 gene tomato building and screening
    Abstract：It has been indicated that Bacillus cereus AR156 induced the disease resistance of Arabidopsis thaliana and tomato by simultaneously activating SA and JA / ET signaling pathways, accompanied by reactive oxygen bursts at the cellular level, callose deposition and chromatin Agglutination and other phenomena, as well as the molecular level of SAR, ISR marker gene expression. We found that the expression of sly-miR482 was significantly reduced after AR156 treatment, and the results were consistent with the results of Northern blot analysis when the AR156 induced the system resistance at different time points. Therefore, we hypothesized that sly-miR482 plays an important role in the induction of plant resistance to Bacillus cereus AR156. The sly-miR482b, sly-miR482c, sly-miR482d and sly-miR482e genes were analyzed by Gateway cloning technique in order to study the mechanism of sly-miR482 in regulating the resistance of Bacillus cereus AR156 to plant system resistance. Clones were used to express overexpressing transgenic plants in Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation.
    Key words: Bacillus cereus, small RNA miR482, induced systemic resistance ; transgenosis ; tomato
    目  录

    摘要1
    关键词1
    Abstract1
    Key words1
    引言1
    1材料与方法2
    1.1材料 2
    1.2方法 3
    1.2.1目的基因材料准备 3
    1.2.2转基因植株构建3
    1.2.3转基因植株筛选3
    2结果与分析3
    2.1目的基因材料准备3
    2.1.1目的基因克隆3
    2.1.2连接过渡载体后转入大肠杆菌4
    2.1.3提取大肠杆菌质粒并作酶切5
    2.1.4同源重组将目的基因连接最终载体6
    2.1.5目的基因转入农杆菌7
    2.2转基因植株构建8
    2.3转基因植株筛选8
    3讨论 9
    3.1目的基因材料获取阶段9
    3.2转基因番茄植株构建筛选阶段9
    3.3总结9
    致谢10
    参考文献10
    过表达sly-miR482基因番茄构建筛选
    引言: microRNA(miRNA)是一类在生物体内普遍存在的长度为20-24nt的非编码小分子RNA，在真核生物基因表达调控过程中起到关键性作用。miRNA可在转录水平与转录后水平，通过碱基互补配对原则识别靶标基因转录的mRNA，通过剪切靶标mRNA使其降解或者抑制其进行翻译，从而抑制靶基因表达。自1993年，miRNA lin-4 在线虫体内被发现后，研究人员陆续在动物体内发现许多新的miRNA，以上研究结果激发了科学家们对于植物体内miRNA的研究兴趣。2002年，4个实验室同时报道称植物体内同样存在miRNA。此后，植物、动物及病毒中大量miRNA被发现并被克隆出。
    近些年，小分子RNA在重要作物病害防治及调控机制研究方面取得了一些重要进展，如：miR319/miR159和miR172在番茄曲叶病毒侵染时被显著诱导表达。小麦接种白粉病后，通过高通量测序发现有24种miRNAs在白粉病菌侵染后被抑制或者诱导表达。最近研究发现，对番茄抗、 感病品种接种尖孢镰刀菌后，通过高通量测序发现miR482f和miR5300在抗病品种中被抑制表达。研究还发现miR482f和miR5300靶标基因突变体植株对番茄枯萎病菌更为敏感，由此表明miRNAs通过作用靶标基因介导对番茄枯萎病的抗病性。此外，水稻和稻瘟病菌互作研究发现，水稻抗病品种接种稻瘟病菌后，miR160和miR164被诱导，miR396被抑制表达，而在感病品种中上述miRNAs表达水平没有发生变化, 而miR169，miR172和miR398b在感、抗品种中均被诱导表达，以上结果表明miR160、miR164以及miR396可以参与植物的ETI途径，miR169，miR172和miR398b参与植物的基础抗性（basal response），以此来调控植物对稻瘟病菌的抗性。由此可见，小分子RNA广泛参与对作物的病害调控作用，具有十分重要的研究意义及应用价值。
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