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2．2．1 优化后的发酵条件 5
2．2．2 优化前后生物量及酶活 5
2．3 发酵罐放大实验 5
2．4 乙草胺含量标准曲线 6
2．5 海藻酸钠(SA)包埋法联合固定 7
2．5．1 海藻酸钠固定化微球乙草胺降解效率 7
2．5．2 海藻酸钠联合固定化条件参数优化 8
2．5．3 乙草胺最大降解量测定 11
2．6 壳聚糖包埋法联合固定 11
2．7 固定化微球保存 12
2．7．1 保存效果 12
2．7．2 可重复利用性 13
3 讨论 13
3．1 液体发酵 13
3．2 联合固定化 14
致谢 14
参考文献 14
乙草胺降解菌Sphingomonas sp.DC-6的发酵、菌剂制备及应用
引言
乙草胺(acetochlor),其化学名称为2-氯-N-(乙氧甲基)-N-(2-乙基-6-甲基)-乙酰胺[1] ，属于酰胺类，是一种具有代表性的芽前处理除草剂，具有高效选择性，是我国目前使用量最大的一种除草剂[2]，其需求量和使用量还将持续增加。乙草胺的化学性质较稳定，溶于多种有机溶剂，土壤吸附常数(0.01-0.02)相对较低，残留的除草剂极易通过渗透作用进入浅层地下水或通过雨水径流渗透到地表水，且残留的乙草胺过量会影响后茬作物生长[3]。尽管普遍认为其毒性不大，但其潜在危害不可忽视，它对人体和动物具有一定的毒性，已被美国环保局定为B-2类致癌物[4]。
去除氯代乙酰胺类除草剂的一条有效途径是利用土壤微生物的生物降解代谢作用，国内外已经有研究报道，如董滨等[5]分离到粘着剑菌属A-3(Ensiferadhaerens)，对10 mg/L乙草胺的降解率为33.6%；倪俊等[6]分离到申氏杆菌Y-4(Shinella sp. )，对浓度50 mg/L乙草胺的降解率达83.3%；并对乙草胺的微生物代谢途径[7]有一定的了解。因此，通过微生物制备乙草胺降解菌制剂来降解乙草胺安全可靠，且具有广泛应用前景。由于良好的可控性，且易于工业放大，一般菌剂的工业化生产大多采取液态发酵的方式[8]。本课题选用实验室已获得的高效降解乙草胺的Sphingomonas sp. DC-6为实验菌株，在液态发酵培养基基础上，进一步改进培养基成分，得到最佳发酵条件，以期达到降低生产成本的目的，从而为工业化生产制备菌剂及其实际应用奠定基础。
在采用高效降解菌进行生物强化处理时，游离微生物因只能在其生活区域降解其可接触到的污染物，不易定殖和易受冲击等缺陷在实际应用中受到一定的限制。固定化技术[9]，是能将游离的酶或微生物定位于有限空间区域的技术方法，通过使用物理、化学方法，将其固定并能保证其活性，使其能不断被重复利用。该方法易控制，可以不同程度地减少细胞流失，避免细胞受到有毒化合物的影响，从而起到保护细胞的作用，扩大了生物降解的应用范围[10]。通过将实验菌株发酵得到的产物制作菌剂并对其固定化，比较不同生物炭联合固定化方法的优劣，并优化固定化条件，使其提高应用于土壤和水体中后的降解率、反复利用率等。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株 高效降解乙草胺菌株Sphingomonas sp. DC-6，现保存于南京农业大学生命科学学院，农业环境微生物工程重点开放实验室。
1．1．2 培养基 基础盐培养基MM (g/L)：NaCl 1.0，NH4NO3 1.0，K2HPO4 1.5，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.2，调节pH为7.0。MM固体培养基添加1.5%的琼脂，121℃、灭菌30 min。