LB培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0。LB固体培养基添加1.5%的琼脂,121℃、灭菌30 min。
1.1.3 主要试剂与材料 乙草胺(纯度>98%,使用前将上述药品溶于色谱甲醇,过滤除菌)、二氯甲烷、甲醇、无水硫酸钠、PBS缓冲液、生理盐水、海藻酸钠、壳聚糖、生物炭(biochar,马尾松树干700℃高温缺氧热解所得,粉碎机粉碎后用40目筛过筛)。
1.1.4 主要仪器 恒温培养箱、恒温鼓风干燥箱、灭菌锅、摇床、冰箱、低温高速离心机、恒温水浴锅、涡旋仪、粉碎机、扫描型紫外-可见光分光光度仪、超净工作台、分析天平、BioFlo/CelliGen 115发酵罐/生物反应器、喷雾干燥仪、液相色谱仪。
1.2 方法
1.2.1 菌种平板活化 将保存的菌种划线接种于加100 mg/kg链霉素的LB平板培养基上,置于30℃恒温培养箱倒置培养3天。挑取平板中单菌落,接种于添加30 mg/kg乙草胺和100 mg/kg链霉素的LB平板上,于30℃倒置培养3天,选用具有较大透明圈的菌落进行下一步实验。
1.2.2 种子液及摇瓶培养基的培养 种子液及摇瓶培养基均为100 ml发酵体系置于250 ml三角瓶中,于30℃恒温摇床中,180 rpm培养。种子液选取已活化的菌种接种培养。
1.2.3 发酵条件优化验证 通过定时取样测定Sphingomonas sp. DC-6摇瓶液态发酵周期中菌体的OD600、干重以及酶活,绘制出Sphingomonas sp. DC-6的生长曲线和产酶曲线及建立OD600、生物量和产酶量的关系。通过碳源、氮源等培养基组分及温度、pH和转速等发酵条件的单因素实验,确定各因素的基本范围。通过Plackett-Burman实验从确定的单因素中找出显著性影响因子,再通过Box-Behnken Design实验得到优化后发酵培养基的各个组分及培养条件。
1.2.4 发酵罐液态发酵验证 按经响应面优化得到的菌株最佳发酵条件配制培养基,装罐,灭菌。设定菌体生长最适宜的温度、pH、接种量和转速等,进行发酵罐液体发酵。
1.2.4.1 培养过程 一个典型培养周期,即菌体生长周期分为:延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期[11]。
各项发酵参数:接种量为7%,25 g/L酵母粉/(NH4)2SO4 (m/m:3/1, g/L),15 g/L葡萄糖,0.5 g/L K2HPO4,0.5 g/L NaCl,0.5 g/L KH2PO4,0.5 g/L MgSO4,pH6.5的发酵培养基中,30℃,180 rpm。在发酵的过程中,需加入适量消泡剂豆油,防止污染。
1.2.4.2 确定发酵液中葡萄糖质量浓度及补糖 定时取样,当发酵液中葡萄糖质量浓度低于初始浓度的1/2时开始补糖,并将葡萄糖质量浓度保持在能获得最高产量发酵液的值。
1.2.4.3 生物量的测定 选取5-10 ml的发酵液,12000 rpm离心10 min,去除上清。保留沉淀用去离子水清洗2-3次,再次离心去除上清,沉淀测重量得鲜重(mg/ml),再烘干至恒重,得干重(mg/ml)。
1.2.4.4 发酵产物收集 按时取样,测定样液中菌体生物量(OD600)。若菌体生长周期进入稳定期,即可停止培养,通过液位电极及相应蠕动泵来完成发酵产物的收集过程。
1.2.5 制备菌制剂 设置适宜的进样量、温度、风速等条件,利用喷雾干燥仪将发酵产物制备成菌粉。
1.2.6 联合固定化
1.2.6.1 吸附法 配成生物炭悬液:将40目生物炭与该菌菌悬液按一定的配比混合,180 rpm,30℃摇床摇匀一定时间,5000 rpm离心10 min,去掉上清液,用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤,再次离心,如此反复洗涤2-3次,最后将离心后的菌体用无菌去离子水配成生物炭悬液,同时做不加菌液(用去离子水代替)的对照组,测定游离菌量(OD600)以及乙草胺降解率。
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