(1) 检测条件[27]
色谱柱:C18;
流动相:甲醇:蒸馏水=60:40
流速:0.8 mL/min
进样量:0.5μL
(2) 混样配制
取0.2g 2-苯乙醇标准品和0.5gL-苯丙氨酸于烧杯中,加蒸馏水混合转移至100mL容量瓶中,定容。
2.6.2 气相色谱法分析发酵液中的乙醇与2-苯乙醇
(1)检测条件
色谱柱:HP-5;
进样口T:250℃;
检测器T:250℃;
进样量:0.2μL;
分流比:30:1;
恒流:0.8mL/min;
程序升温:40℃后以20℃/min速率升温到250℃,保持2min。
(2)混样配制
取0.2g2-苯乙醇标准品和0.1g无水乙醇于烧杯中,加蒸馏水混合转移至100mL容量瓶中,定容。
2.6.3木糖含量的测定
DNS法测还原糖[25][26],DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下,二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应,生成3-氨基-5-硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下显棕红色,且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理,用比色法测定还原糖含量。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关,而对还原糖的种类没有选择性,故DNS方法适合用在多糖(如纤文素、半纤文素和淀粉等)水解产生的多种还原糖体系中。
3.结果与分析
3.1 2-苯乙醇与L-苯丙氨酸的含量测定
2-苯乙醇与L-苯丙氨酸混合标准样品的液相图谱,如图3-1。根据外标法的定性定量的性质,2-苯乙醇保留时间为1.382min,L-苯丙氨酸保留时间为2.525min;计算样品浓度采用计算公式:
(1)
由公式(1)及图3-1确定了2-苯乙醇与L-苯丙氨酸的计算公式
图3-1 2-苯乙醇与L-苯丙氨酸混合标准样品的液相图谱
3.2 2-苯乙醇与乙醇的含量测定
乙醇与2-苯乙醇混合标准样品的气相图谱,如图3-2。乙醇保留时间为2.490min,2-苯乙醇保留时间为6.408min;由公式(1)及图3-2确定了乙醇和2-苯乙醇的计算公式。
图3-2 乙醇与2-苯乙醇混合标准样品的气相图谱
3.3 木糖含量标准曲线的绘制
将木糖在106℃下烘箱干燥至恒重,配成1g/L标准溶液,如表3-1加入不同量标液于25mL具塞量筒中:
表3-1 溶液配制
管号 1 2 3 4 5 6
葡萄糖标准溶液(mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水(mL) 1.0 0.6 0.2 0.8 0.4 0
DNS试剂(mL) 1 1 1 1 1 1
各试管分别加入表中试剂摇匀后,在沸水浴中加热5min。取出后用流水迅速冷却至室温。每管补加蒸馏水定容至刻度线,摇匀后在540nm波长下测OD值[23]。以木糖浓度为横坐标,以OD值为纵坐标绘制标准曲线。如图4所示:
图3-3 木糖浓度标准曲线
3.4 菌种筛选
在摇床培养48小时后,取各发酵液进行分析其生产2-苯乙醇的能力,对选中的5种酵母菌株进行筛选。结果如图3-4所示。
图3-4 酵母菌株的2-苯乙醇产量对比
从图3-4中可知,在培养组成以及转化条件相同情况下,B菌株(梅山活性干酵母)与其他不同酵母菌株的转化合成的2-苯乙醇浓度差别非常明显,B菌株(梅山活性干酵母)的转化合成的2-苯乙醇浓度达到1.035g/L,而其他不同酵母菌株转化合成的2-苯乙醇浓度均在0.4-0.7g/L之间,所以本次研究所选用的菌种为梅山活性干酵母。
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