1. REK大肠杆菌的鉴定
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
吸附柱 高速离心机 移液枪 恒温振荡器 EP管 电泳仪、紫外检测仪、微量加样器、微波炉
1.1.2 试剂
SolutionI(加入RNaseA),II,III
Elution Buffer:65 °C预热
NdeI#R0111s酶
BamHI#R0136s酶
6×Loading Buffer
花青素
Marker
50×TAE缓冲液(50 ml):称量Tris 12.1 g,Na2EDTA•2H2O 0.9306 g于烧杯中;向烧杯中加入约40 ml纯化水,充分溶解;加入2.855 ml的冰乙酸,充分溶解;用NaOH调pH至8.3,加纯化水定容至50 ml后,高压灭菌,室温保存.(已配制)
1×TAE缓冲液:取50×TAE 8 ml 加去离子水定容至400 ml.
1.1.3 琼脂糖凝胶配制
(1)将电泳仪水平放在桌面上,调整仪器四角的螺钉,使仪器中央的气泡位于圆圈中央.将黑色密封橡胶条插入制胶板两侧,制胶板放入电泳槽中.根据样品浓度与上样量选择梳齿,窄梳齿在配胶时可上样7 µl,宽梳齿在配胶25 ml时可上样10 µl.在黑色电极一侧放置样品梳,调整梳齿位置,距离制胶槽底部约1mm.(梳齿切忌不可接触到胶槽底部)
(2)根据REK重组质粒及其酶切产物的长度,适用1.0%-1.25%的琼脂糖凝胶.配制25mL 1.0%的琼脂糖凝胶:称取0.25 g琼脂糖,置于干净的100 ml烧杯中,加入25 ml 纯化水,500 ul 50×TAE缓冲液,充分搅匀,盖上平皿,用微波炉加热,使之彻底融化.(一般以100火力加热1 min;注意:加热期间听到沸腾的声音要立即打开微波炉门,防止溶液溢出)稍微冷却,加入15 µl花青素混匀,倒入制胶槽,静置约20min,待琼脂糖彻底凝固后,轻轻拔出样品梳.即制成1.0%的琼脂糖凝胶.(倒胶时不可产生气泡)
1.2 REK重组质粒提取流程
(1)DNA吸附柱平衡处理:
向吸附柱中加入200ul buffer CBS,12000rpm离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回到收集管中备用.
(2)视菌液生长情况,一般取4 ml LB培养基过夜培养的菌液,8000 rpm离心1 min,弃去上清
(3)加入300 ul SolutionI ,用枪头吹打,充分悬浮菌液.
(4) 加入500 ul SolutionII ,立即温和并充分上下翻转混合4-6次,使菌体充分裂解并形成透亮的蛋清状溶液.(此步骤时长不宜超过5 min)
(5)加入700 ul SolutionIII ,温和并充分地上下翻转混合8-10次,室温静置5 min.然后12000 rpm,离心10 min .
(6)将步骤5中的上清液转移至套放于2ml收集管内的DNA 吸附柱中,室温6000 rpm 离心1 min,取出DNA 吸附柱,倒掉收集管中废液.
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