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    色氨酸(Trp)不仅是人体必需氨基酸之一,也是猪的第四限制性必需氨基酸,国内外学者对其都有大量研究,发现色氨酸及其代谢产物5-羟色胺与动物采食量、免疫、抗应激等生理反应密切相关[4]。
    钙(Ca)是机体内最重要的矿物元素之一,在各项生理活动中都处于必不可缺的地位,参与一切生命活动,例如文系细胞的正常生理功能,文持细胞膜两侧生物电位正常,文持神经及神经-肌肉传导功能和正常的肌肉伸缩与舒张功能。自Brown等[5]首次于牛甲状旁腺细胞中克隆出钙敏感受体(CaSR)后,在人的甲状旁腺和大鼠肾脏中也发现了CaSR的表达[6-8], CaSR能被激活后,能够启动与其有关的信号通路,进一步调控细胞的增殖与分化和多种激素的分泌。
    目前关于氨基酸和蛋白质对肠胃中CaSR的表达及影响方面的研究在家畜和其他动物上还比较少,对机体各项生命活动的调控作用也尚不明确。为此,本课题设计不同浓度色氨酸,通过不同条件的体外灌流实验,测定胃窦生长抑素、胃泌素分泌活性,揭示CaSR介导色氨酸诱导猪胃窦胃肠激素SS、gastrin分泌的规律 为后继续研究CaSR调节动物生理活动相关的机制及其发挥的生理功能奠定理论基础。
    1  材料与方法
    1.1    建立表面灌流系统
    表面灌流装置参照谈寅飞[9]等人的方法并加以改进而成(如图1-1),该系统包括氧气瓶、储液瓶、恒流泵、灌流小室、恒温水浴锅、收集器、烧杯和硅胶管8个部分。 灌流小室(如图1-2)是由5mL的一次性注射器改装而成,包括尼龙网(400目)、针头、橡胶塞和注射器4个部分。
     灌流系统
    图1-1:灌流系统 Superfusion system
    1.氧气瓶 Oxygen pump; 2. 储液瓶Media reservoir; 3.恒流泵 Peristaltic pump; 4.灌流小室 Chamber;
    5.玻璃管 Glass tube; 6.水浴锅 Water bath; 7.收集器 Collector. 8.硅胶管Silicone tube
    图1-2:灌流小室 Chamber
    1.    尼龙网(400目)Nylon filter platform 2. 针头Needle3. 橡胶塞 Rubber stoper 4. 注射器Syringe
    1.2  试剂和仪器
    Kreb’s 培养液;色氨酸(Trp)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自Sigma-Aldrich(中国,上海); cinacalcet和NPS2143均购自MedChem Express(中国,上海);猪生长抑素SS(ANG-E31118P,AOGENE)、胃泌素gastrin(ANG-E31183P,AOGENE)ELISA试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司(中国,南京);
    pH计;酶标仪(Thermo,USA);低温高速离心机(Eppendorf,Germany)。

    1.3  样品处理
    1.3.1  配置Kreb’s培养液    Kreb’s培养液(136.87 mM NaCl,4.02 mM KCl,2.10mM MgCl2,1.80 mM  CaCl2,25.18mM  HEPES,pH = 7.2)使用去离子水配置然后进行高压灭菌。各项试验均使用Kreb’s培养液作为基础液进行处理用作灌流液,分别按试验设计安排进行配制;对照组均使用Kreb’s培养液作为灌流液。
    1.3.2  组织处理    将从屠宰场取来的新鲜胃组织剪取胃窦部分,于磷酸盐缓冲液(PBS)中洗去组织粘膜上附着物,剪碎,称量,用于后续灌流以及胃泌素、生长抑素分泌活性研究,将灌流前以及灌流后的组织置于冻存管中置于液氮中保存。
    1.4  试验设计与样品收集
    1.4.1  灌流实验    将洗净的胃组织全部剪成约1 mm2的组织块,混匀,称重,然后装入灌流小室中,每个灌流小室装400 mg。使用不含Trp的Kreb’s培养液进行预灌流,速度为6 mL/h,30分钟后使用刺激液进行灌流,并作为0 min,每隔20分钟收集一管灌流液,持续收集120分钟。在整个实验过程中,持续通入含5% CO2的O2,在灌流结束后,用-20℃和液氮保存所收集到的灌流液和胃窦组织块,待测。
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