4) 将离心管放入球磨仪(MM400,Retsch)中,震荡2 次,每次2 min(震荡频率为28次/秒),此过程要注意配平;
5) 60℃水浴1 h,每隔20 min将离心管上下混匀震荡数次;
6) 加入700μL体积的氯仿充分震荡后12000 rpm离心5 min;
7) 抽取上清450μL转入1.5 mL离心管中;
8) 加入900μL无水乙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃沉淀1.5h以上;
9)12000 rpm,4℃离心5 min,弃上清,沉淀用75%的乙醇洗涤2次,自然风干后溶于40 μL ddH2O中,-20℃保存备用。
1.5.2 苯醚甲环唑抗、感菌株cyt 51基因的克隆及分析
参照NCBI数据库上的数据(gi: 18733977),葡萄炭疽病菌的cyp51基因序列,使用Primer Premier 5软件在基因的上下游100bp外设计引物,设计了一对引物CYP51-F/CYP51-R(CYP51-F: 5′-CCAACAGGGGTCAAAG-3’ / CYP51-R: 5′-GACGGACAGGGGGTAC-3′)可以扩增含有全部cyp51基因的片段。
运用引物143-F/143-R,以8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增体系及反应程序如下。
扩增体系:
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL) 1 μL
2×Phanta Max Buffer 2.5 μL
dNTP mixture(10 mM of each) 1 μL
上游引物CYP51-F(10 μM) 2 μL
下游引物CYP51-R(10 μM) 2 μL
模板DNA(50 ng/μL) 1μL
ddH2O 18 μL
总体系 50 μL
扩增反应程序:95℃预变性3min;95 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃充分延伸5 min;4 ℃保存。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化,送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序。使用BioEdit软件对苯醚甲环唑抗、感菌株cyp51的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行比对分析。本试验重复3次。
2 结果与分析
2.1感抗菌株对苯醚甲环唑的EC50测定
采用菌丝生长速率法测定了2016年从江苏镇江不同葡萄大棚采集分离的80株炭疽菌(Colletotrichum spp)单孢菌株对苯醚甲环唑的敏感性,建立敏感性基线1.9906±0.04494μg/ml,EC50值分布成单峰曲线(图1 注:本数据由马微微完成)。
从采集分离的80株炭疽菌单孢菌株中,挑取1株苯醚甲环唑敏感菌株及8株抗性菌株,采用菌丝生长速率法测定EC50(表1),结果表明:苯醚甲环唑敏感菌株与抗性菌株的EC50差别不大,说明炭疽菌对苯醚甲环唑的抗药性不明显。
- 上一篇:番茄免疫受体蛋白Sw-5b与番茄斑萎病毒移动蛋白NSm互作分子机制研究
- 下一篇:稻田天敌拟环纹豹蛛负幼行为研究
-
-
-
-
-
-
-
中考体育项目与体育教学合理结合的研究
电站锅炉暖风器设计任务书
酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸
十二层带中心支撑钢结构...
当代大学生慈善意识研究+文献综述
河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状
杂拟谷盗体内共生菌沃尔...
大众媒体对公共政策制定的影响
乳业同业并购式全产业链...
java+mysql车辆管理系统的设计+源代码