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    4)    将离心管放入球磨仪(MM400,Retsch)中,震荡2 次,每次2 min(震荡频率为28次/秒),此过程要注意配平;
    5)    60℃水浴1 h,每隔20 min将离心管上下混匀震荡数次;
    6)    加入700μL体积的氯仿充分震荡后12000 rpm离心5 min;
    7)    抽取上清450μL转入1.5 mL离心管中;
    8)    加入900μL无水乙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃沉淀1.5h以上;
    9)12000 rpm,4℃离心5 min,弃上清,沉淀用75%的乙醇洗涤2次,自然风干后溶于40 μL ddH2O中,-20℃保存备用。
    1.5.2 苯醚甲环唑抗、感菌株cyt 51基因的克隆及分析
    参照NCBI数据库上的数据(gi: 18733977),葡萄炭疽病菌的cyp51基因序列,使用Primer Premier 5软件在基因的上下游100bp外设计引物,设计了一对引物CYP51-F/CYP51-R(CYP51-F: 5′-CCAACAGGGGTCAAAG-3’ / CYP51-R: 5′-GACGGACAGGGGGTAC-3′)可以扩增含有全部cyp51基因的片段。
    运用引物143-F/143-R,以8株苯醚甲环唑抗性菌株及1株敏感菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增体系及反应程序如下。
    扩增体系:
    Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL)    1 μL
    2×Phanta Max Buffer    2.5 μL
    dNTP mixture(10 mM of each)    1 μL
    上游引物CYP51-F(10 μM)    2 μL
    下游引物CYP51-R(10 μM)    2 μL
    模板DNA(50 ng/μL)    1μL
    ddH2O    18 μL
    总体系    50 μL
    扩增反应程序:95℃预变性3min;95 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃充分延伸5 min;4 ℃保存。
    PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化,送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序。使用BioEdit软件对苯醚甲环唑抗、感菌株cyp51的碱基序列及其编码的氨基酸序列进行比对分析。本试验重复3次。
     2  结果与分析
    2.1感抗菌株对苯醚甲环唑的EC50测定
    采用菌丝生长速率法测定了2016年从江苏镇江不同葡萄大棚采集分离的80株炭疽菌(Colletotrichum spp)单孢菌株对苯醚甲环唑的敏感性,建立敏感性基线1.9906±0.04494μg/ml,EC50值分布成单峰曲线(图1  注:本数据由马微微完成)。
    从采集分离的80株炭疽菌单孢菌株中,挑取1株苯醚甲环唑敏感菌株及8株抗性菌株,采用菌丝生长速率法测定EC50(表1),结果表明:苯醚甲环唑敏感菌株与抗性菌株的EC50差别不大,说明炭疽菌对苯醚甲环唑的抗药性不明显。
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