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    UGT40D1R:TTCTAGCTCTAAAACCCGATGATATCCAAATGAAC。
       sgRNA的合成依照Precision gRNA Synthesis Kit说明书完成,具体过程如下。
    (1)合成sgRNA的DNA模板
    配制25μL PCR反应体系:
    Pfusion™ High-Fidelity PCR Master Mix           12.5μL
    Tracr Fragment + T7 Primer Mix                  1μL
    0.3μM Target F1/R1 oligonucleotide mix            1μL
    Nuclease-free water                             10.5μL
    PCR程序98℃10秒,32个循环(98℃ 5秒, 55℃ 15秒),72℃1分钟,4℃保存。
    (2)体外转录sgRNA
    配制20μL反应体系
    NTP mix (100 mM each of ATP, GTP, CTP, UTP)      8 μL
    gRNA DNA template                             6 μL
    5X TranscriptAid. Reaction Buffer                  4 μL
    TranscriptAid. Enzyme Mix                       2 μL
    37℃孵育2-3小时;
    在反应体系经过转录反应后加入1μL 的DNaseI并在37℃孵育15分钟。
    (3)纯化转录出的sgRNA
    ①将IVT反应体系的体积用无核酸酶的水加到200μL;
    ②加入100μL的结合缓冲液。通过移液管混合完全;
    ③加入乙醇(>96%)并通过移液管混合完全;
    ④将混合液转移至 GeneJET™ RNA Purification Micro Column,并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液;
    ⑤加入700 μL的清洗缓冲液1(用13mL大于96%的乙醇稀释)并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液;
    ⑥加入700 μL的清洗缓冲液2(用30mL大于96%的乙醇稀释)并且在14000g转速下离心30-60秒。舍弃废液并重复;
    ⑦在14000g转速下将净化柱再次离心60秒以完全去除残留的清洗缓冲液,并且将净化柱转移到一个干净的1.5mL收集管中;
    ⑧在净化过滤柱的中央加入10μL的无核酸酶水,并且在14000g转速下离心60秒来洗提gRNA。
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