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    摘要：硫化氢（H2S）是新发现的一类气体信号分子，参与植物各类生理反应，能够有效响应逆境胁迫，具有重要研究意义。其中拟南芥Des1基因所编码的半胱氨酸脱巯基酶催化产生H2S，是植物内源产生H2S的重要方式，因而研究DES1与细胞内其他蛋白互作能帮助了解DES1的作用机制和调控方式。本课题通过PCR技术克隆了Des1基因的编码区序列，并利用限制性内切酶与T4连接酶成功构建Des1-pGBKT7融合表达载体；利用热激法将所构载体转化至酵母Y2Hgold感受态，得到能稳定表达DES1的酵母菌株。通过载体构建和酵母转化初步完成酵母双杂交筛选的准备工作，后续需进行酵母自激活验证及杂交筛选等过程得到未知蛋白序列。26809
    毕业论文关键词：载体构建；Des1；酵母双杂交；基因克隆
    Cloning and Vector Construction of Des1 in Arabidopsis Thaliana for Yeast Two-hybrid System
    Abstract：Hydrogen sulfide(H2S) is the newly discovered gas signal molecules of great research significance, which is involved in various physiological and biochemical reactions in plants, and can effectively participate in plant stress response. Since the Des1 gene encoding cysteine desulfhydrase in Arabidopsis thaliana helps catalyze and produce hydrogen sulfide, which is an important way to provide endogenous hydrogen sulfide, the study of DES1 and its interaction between other proteins in plant cell can help understand the mechanism and regulation of DES1 in certain degree. In this study, we clone and amplify gene Des1 coding sequence using PCR, and successfully construct the Des1-pGBKT7 expression vector by restriction endonuclease and T4 ligase; we transform the recombinant vector into the yeast Y2Hgold using heat shock method, and get the yeast that can stably produce DES1. The preparation work is basically finished through the successful vector construction and yeast transformation. In order to get the unknown protein sequence, test for autonomous reporter gene activation and cell toxicity and two-hybrid screening by yeast mating should be done next.
    Key words: vector construction；Des1；yeast two-hybrid system；gene cloning
    目  录

    摘要3
    关键词3
    Abstract3
    Key words3
    引言3
    1材料与方法4
    1.1实验材料 4
    1.1.1植物材料及其培养4
    1.1.2菌株及质粒载体4
    1.1.3主要试剂5
    1.1.4主要仪器设备5
    1.2.实验方法 5
    1.2.1总RNA的提取5
    1.2.2 PCR引物设计5
    1.2.3 cDNA的合成6
    1.2.4 PCR扩增拟南芥DES1编码区序列6
    1.2.5 PCR产物回收6
    1.2.6表达载体的构建7
    1.2.7大肠杆菌感受态的制备7
    1.2.8连接产物的热激转化8
    1.2.9菌液PCR验证8
    1.2.10 TaKaRa质粒抽提试剂盒提取质粒8
    1.2.11酵母感受态的制备与转化9
    2结果与分析9
    2.1拟南芥Des1基因的克隆和载体构建9
    2.2 Des1-pGBKT7转化酵母Y2Hgold菌株13
    3讨论13
    致谢14
    参考文献14
     拟南芥Des1基因的克隆与酵母双杂载体构建
    引言
    在一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后，硫化氢（H2S）被证实是第三种气体信号分子。在植物方面，H2S在生长发育、种子萌发、气孔运动、延缓衰老以及响应逆境胁迫中发挥着重要作用，并参与机体内必要的生理生化反应[1-3]。最初H2S被认为是一种工业废气，对生物普遍存在危害作用，高浓度的H2S会损伤细胞线粒体内的细胞色素C氧化酶，从而减弱呼吸作用，影响机体的正常运作，有相关研究发现25 μmol/L H2S即可使细胞线粒体呼吸作用强度降低一半[4]。而后来H2S被发现在动植物体内可通过半胱氨酸代谢产生，并参与机体重要的生命活动，从而成为现代生物学的研究热点之一。
    半胱氨酸是许多重要生物分子代谢前体，L-半胱氨酸脱巯基酶（L-cysteine desulfhydrase, L-CD）和D-半胱氨酸脱巯基酶（D-cysteine desulfhydrase, D-CD）分别以L/D-半胱氨酸为底物产生H2S。本课题研究的拟南芥Des1（AT5G28030）就是L-半胱氨酸脱巯基酶的编码基因，该酶位于细胞质且至今未在细胞质发现其他功能相同的酶[5]，同时DES1也是O-乙酰基-L-丝氨酸（硫醇）裂解酶（O-acetylserine（thiol）lyase, OASTL）类似蛋白。OASTL酶可以携带还原态硫并将其结合到O-乙酰基-L-丝氨酸（O-acetylserine, OAS）来合成半胱氨酸，该过程是半胱氨酸脱巯基酶脱硫的逆反应[6]。Álvarez等[7]将DES1与其他拟南芥OASTL氨基酸序列进行对比发现，OAS-A1的74到78残基为高度保守序列，形成一个环状结构并能结合还原态硫合成半胱氨酸，但DES1 75位的甘氨酸残基取代了保守序列中的丝氨酸残基。另外，DES1用于与丝氨酸乙酰转移酶相互作用的位点—β8A~β9A曲面环并不保守，存在部分氨基酸序列的变化。而且进一步研究证明，该蛋白质催化L-半胱氨酸降解，而不是半胱氨酸的生物合成。DES1对L-半胱氨酸的Km值为0.4 mmol/L，而OASTL酶的Km值则为5.2 mmol/L，由酶学数据可知DES1对L-半胱氨酸的亲和力较其它OASTL酶高出13倍，这表明DES1对L-半胱氨酸具有更高的底物亲和力，参与催化其降解过程。因此，DES1虽然是OASTL类似蛋白，但其本质是L-半胱氨酸脱巯基酶，催化L-半胱氨酸降解并内源产生H2S。可见DES1在植物的生命活动中起到了重要的作用，但是对于DES1的具体作用形式和调控机制仍不清楚，研究其与机体内其他蛋白的互作能够帮助明确DES1的功能并鉴定未知蛋白，具有重要意义。
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