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    1  材料与方法
    1.1  材料
    1.1.1  植物材料    
    ‘巨峰’葡萄(Vitis vinifera cv  Kyoho)果实采自江苏农博园葡萄种植基地。果实大小如图1所示。
    图1 植物材料
    Fig 1 Plant material
    1.1.2  菌株和载体    
    大肠杆菌菌株(E coli)为DH5α;农杆菌菌株为EHA105;载体为pCAMBIA1302。以上菌株和载体均由本实验室保存。
    1.1.3  酶及生化试剂    
    Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、PCR试剂盒购于TaKaRa宝生物工程有限公司;PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于捷倍思生物基因技术有限公司;B5、琼脂、蔗糖、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化钠均购于索莱宝(Solarbio)科技有限公司。
    1.1.4  引物与测序    
    引物合成及DNA测序均由上海生工(Sangon)完成。
    1.1.5  培养基
    (1)B5固体培养基:B5 3 21g/L;琼脂8 5g/L;蔗糖30g/L;6-BA 0 6mg/L;NAA 6mg/L。
    (2)LB固体培养基:15g琼脂;5g酵母提取物;10g胰蛋内胨;10gNaCl,用NaOH调节pH值为7 0,用蒸馏水定容至1L,121℃、高压灭菌。
    (3)LB液体培养基:5g酵母提取物;10g胰蛋内胨;10gNaCl,用NaOH调节pH值为7 0,用蒸馏水定容至1L,121℃、高压灭菌。
    1.1.6  主要仪器与设备
    恒温水浴锅、高速离心机、超净工作台、PCR仪、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统DNA数据检测仪、恒温摇床、恒温培养箱、微量分光光度计、高压蒸汽灭菌锅。
    1.1.7  生物信息学分析
        通过National Center for Biotechnology Information即NCBI获得葡萄Rs基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。
    1.2  方法
    1.2.1  葡萄基因组总RNA的提取及cDNA合成
        采用改进后的CTAB法提取巨峰葡萄果肉和果皮总RNA,具体操作步骤如下。于预冷的研钵中加入适量葡萄果肉或果皮,同时加入液氮快速充分研磨成粉末。将粉末转入2ml离心管,每管加入1ml的A试剂(由0 1M Tris、0 3M山梨醇和10%PEG配制而成)和2%β-ME,4℃、8000rpm离心5min,弃上清,加入1ml的B试剂(由0 1M Tris、2% CTAB、1 4M NaCl和20mM EDTA配制而成,并用H3BO3调节PH至5 4)和2%β-ME,55℃水浴20min,其中每10min上下晃动一次,后预冷,加入100μl的C试剂(5M KAC)、100μl的C2H2OH和600μl氯仿,涡旋,后4℃、10000rpm离心10min,取上清900μl于新的2ml离心管中,并加入等体积氯仿,涡旋,后4℃、10000rpm离心10min。取上清600μl于1 5ml离心管中,加入1/3VLiCl、0 8V异丙醇和1%β-ME,于-20℃冰箱中静置2-4h后洗沉淀并点样、电泳检测RNA质量,同时取1μl用微量分光光度计测其浓度与纯度。按照TaKaRa Prime ScriptTM  RT-PCR Kit操作说明进行cDNA第一链的合成。
    1.2.2  目的基因的分子克隆
    根据GenBank中已报道的葡萄白藜芦醇合酶基因序列(登录号:NC_012022 3)设计PCR扩增引物:上游引物rs1:5’-TTTAGAAACGCTCAACGTGCC-3’;下游引物rs2:5’- GCACAACAGTTTCGATGGTCA-3’。根据载体pCAMBIA1302,选取两个酶切位点,加酶切后上游引物rs3:5’- GAAGATCTTTTAGAAACGCTCAACGTGCC-3’;下游引物:rs4:5’-CTAGCTAGCGCACAACAGTTTCGATGGTCA-3’引物由擎科生物有限公司合成。使用25 0µl的PCR反应体系:l0xPCR缓冲液2 5µl,提取的样品cDNA 2 0µl,上游引物rs1(25mM)1 0µl,下游引物rs2(25mM)1 0µl,dNTPs(10 mM)0 5µl,rTaq DNA聚合酶0 2µl,灭菌的无核酸重蒸水17 8µl,离心混匀。在PCR仪中94℃预变性5min后,按以下程序进行PCR扩增:94℃变性30s;53-64℃的温度梯度退火30s;72℃延伸2min,共35个循环;最后72℃延伸l0min结束反应。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。按照胶回收试剂盒说明回收DNA,以回收产物为模板利用引物rs3、rs4跑PCR,并回收目的片段。
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