1 材料与方法
1.1植物实验材料
本试验的供试材料为南京农业大学研究所种植的黄金芽(C. Sinensis cv. huangjinya)、安吉白茶(C. sinensis cv. Anjibaicha)、迎霜(C. sinensis cv. Yingshuang)二年生、自然条件下生长的扦插幼苗。用一正常的黄金芽品种茶树幼叶进行DNA提取,并使之作为GGT1和GGT3基因克隆模版。分别对黄金芽、安吉白茶、迎霜 3 个茶树品种的正常植株进行低温(4℃)和高温(38℃)逆境胁迫处理,并用在自然状态下(室温 20℃)未处理的二年生扦插植株为对照,采集处理 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h 的茶树叶片,提取叶片样品的 RNA 并反转录成 cDNA,用于实时荧光定量 PCR。
1.2总RNA提取
总RNA的提取采用Quick RNA Isolation Kit(北京华越洋公司)试剂盒提取。实验过程中使用的全部塑料制品均经0.1% DEPC水浸泡过夜,灭菌后烘干密闭保存,玻璃制品于烘箱内180 °C干热灭菌3 h。操作步骤如下:
(1)准确称取0.1 g叶片组织,将叶片在液氮中磨碎。加入1 mL细胞裂解液,待研钵中液体澄清后转入1.5 mL离心管中。
(2)将离心管中加入300µL去蛋白液和200µL自备氯仿在振荡器上振荡30s混匀。
(3)4 °C,12000 rpm离心5-10 min,取上清,转入一个新的无RNase的离心管中。
(4)加入等体积漂洗液,充分颠倒混匀。然后将混合液转入离心吸附柱中,12000 rpm 室温离心1 min。
(5)加入500µL洗柱液,12000 rpm 室温离心1 min。再加入500µL洗柱液,重复一遍,12000 rpm离心1 min。
(6)膜上消化DNA,重复一遍。
(7)在离心吸附柱中加500µL去酶液,盖上盖后颠倒数次,12000 rpm 室温离心1 min。
(8)室温空离12000 rpm 2min。
(9)将吸附柱转入新的离心管中,加入50-100µL洗脱液,室温放置3-5 min,4 °C,12000 rpm离心1min。弃吸附柱,将所得RNA保存于-80 °C。
1.3总RNA的纯化及检测
(1) 纯化体系
总RNA (μg/μL) 20-50 μg (42.5 μL)
10×DNase buffer 5 μL
DnaseI (5 U/μL) 2 μL
RNase 抑制剂 (40 U/μL) 0.5 μL
DEPC-H2O Up to 50 μL
(2)37 °C温浴30 min,降解DNA,然后70 °C反应10 min以灭活DNase。
(3)转入500 μL离心管中加入50 μL DEPC-H2O,再加入100 μL(与混合液等量)酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分混匀,4 °C,12000 rpm离心10 min。
(4)取上清,移入另一微量离心管中,加入100 μL(与上清等量)氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,4 °C,12000 rpm离心10 min 。
(5)取上清,加入 10 μL(1/10 体积)3 M NaAc(pH=5.3)和250 μL(2.5倍体积)预冷的异丙醇(无水乙醇),-20 °C沉淀1-2 h 。
(6)4 °C,12000 rpm离心20 min,弃上清,用预冷的75% 乙醇洗RNA沉淀2~3 次,于超净工作台中晾干5~10 min,沉淀溶解于30 μL DEPC-H2O中。
(7)取3 μL产物用Agarose凝胶电泳检测,电泳电压为120 V,20 min后观察并拍照。
(8)用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和OD值,根据OD260/OD280和OD260 /OD230的比值判断RNA的质量。
1.4cDNA合成
采用了TaKaRa公司的M-MLV反转录酶及特殊引物AP:GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17进行实验。
具体操作过程如下:
向灭菌的200 μL离心管中加入下列试剂:
模板RNA 1 ng~1 μg
AP (10 μM) 1 μL
RNase free ddH2O up to 15 μL
70 °C保温5 min后迅速置于冰上急冷5 min。
离心数秒使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。
在管中继续加入如下反转录反应液:
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