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    后进行反转录操作,步骤如下所述。配制下列反应液于微量离心管中:
    Total RNA    20-50 μg
    10×DNase I Buffer    5 µl
    Recombinant DNase I (RNase-free)    2 μl (10 units)
    RNase Inhibitor    20 units
    DEPC-treated water    up to 50 μl
    Total    50 µl
    37℃反应20-30分钟;加入0.5 M EDTA溶液2.5 μl,混匀,于80℃加热处理,2min后再用DEPC treated water定容至100 μl,使 Recombinant DNase I失活;加入3 M醋酸钠10 μl、及冷乙醇250 μl,混匀后放置于-80℃20 min;4℃,12,000 rpm离心10 min,弃上清;再加入70%冷乙醇洗净,设置4℃,12,000 rpm离心5 min,弃上清;干燥沉淀;用适量的DEPC treated water溶解后,进行Agarose电泳操作,以确认是否除去基因组DNA,同时测定RNA的浓度;在冰浴的试管中加入如下反应混合物:
    Total RNA    1 μg
    Oligo(dT)18(0.5 μg/μl)    1 µl
    DEPC-treated water    up to 11 μl
    Total    11 µl
    混匀后于70℃保温10 min,迅速置于冰上2 min后;加入以下反应液:
    5 × M-MLV Buffer    4 μl
    RNase Inhibitor (40U/μl)    0.5 µl
    dNTPs Mixture (10 mM)    2 μl
    RTase M-MLV (RNase H-)(200 U/μl)    1 μl
    DEPC-treated water    1.5 μl
    Total    9 µl
    总反应体积20 μl,42℃ 1 h,70℃ 15 min;取出置于-20℃保存。
    反转录后通过PCR扩增进行全长验证,琼脂糖凝胶电泳得到目的片段,后进行切胶纯化回收,回收产物进行连接并转化大肠杆菌DH5α。
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