后进行反转录操作,步骤如下所述。配制下列反应液于微量离心管中:
Total RNA 20-50 μg
10×DNase I Buffer 5 µl
Recombinant DNase I (RNase-free) 2 μl (10 units)
RNase Inhibitor 20 units
DEPC-treated water up to 50 μl
Total 50 µl
37℃反应20-30分钟;加入0.5 M EDTA溶液2.5 μl,混匀,于80℃加热处理,2min后再用DEPC treated water定容至100 μl,使 Recombinant DNase I失活;加入3 M醋酸钠10 μl、及冷乙醇250 μl,混匀后放置于-80℃20 min;4℃,12,000 rpm离心10 min,弃上清;再加入70%冷乙醇洗净,设置4℃,12,000 rpm离心5 min,弃上清;干燥沉淀;用适量的DEPC treated water溶解后,进行Agarose电泳操作,以确认是否除去基因组DNA,同时测定RNA的浓度;在冰浴的试管中加入如下反应混合物:
Total RNA 1 μg
Oligo(dT)18(0.5 μg/μl) 1 µl
DEPC-treated water up to 11 μl
Total 11 µl
混匀后于70℃保温10 min,迅速置于冰上2 min后;加入以下反应液:
5 × M-MLV Buffer 4 μl
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.5 µl
dNTPs Mixture (10 mM) 2 μl
RTase M-MLV (RNase H-)(200 U/μl) 1 μl
DEPC-treated water 1.5 μl
Total 9 µl
总反应体积20 μl,42℃ 1 h,70℃ 15 min;取出置于-20℃保存。
反转录后通过PCR扩增进行全长验证,琼脂糖凝胶电泳得到目的片段,后进行切胶纯化回收,回收产物进行连接并转化大肠杆菌DH5α。
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