2) 赤霉素GA3、多效唑
3) 反转录试剂盒(Taqman. Transcription Kit 200 Reactions )
4) 无水乙醇、氯仿、异丙醇:北京化学试剂公司
5) PCR引物由南京金斯瑞生物公司合成。
6) 其他常规试剂由南京农业大学种业科学系实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 赤霉素处理
配置GA3和PAC(paclobutrazol多效唑,赤霉素抑制剂)水溶液,浓度分别为0.1mmol/L和0.01mmol/L。挑选成熟饱满的水稻种子,培养至三叶期分为6组,分别标记为CK1、CK2、GA31、GA32、PAC1和PAC2。之后对应地分别进行整株喷施ddH2O、GA3和PAC溶液,处理24小时后挑选幼嫩叶片。取样后用DEPC处理水清洗并用灭菌纸擦干,迅速将样品放入离心管并液氮瞬时冷冻以备后续提取RNA,并将部分材料放置超低温冰箱(-80℃)保存备用。
1.2.2 总RNA提取与质量检测
由于RNA非常不稳定,实验中所用的离心管、微量取样器吸头等器具均先用DEPC水处理并进行高温灭菌处理,所用研钵及各种玻璃器皿均需经过酒精灼烧,以除去RNA酶。参照Trizol试剂盒说明书进行RNA提取。
1) 在液氮环境下用研钵研磨水稻叶片,取100mg左右粉末放入预冷的2ml的离心管中,加入1ml左右的Trizol抽提液,轻轻摇匀,室温放置10min。于-80℃冻30min以上,取出后在室温下解冻,13000rpm 4℃离心5-10min(离心机需要预冷至4℃)。
2) 取出上清液加入200μL氯仿,轻轻上下颠倒混匀,冰上放置5-10min,13000rpm 4℃离心10min。
3) 取出上清液加入500μL异丙醇,上下来回颠倒混匀,-20℃放置10min(使沉淀更加彻底),12000rpm 4℃离心10min,弃上清液。
4) 在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解,静置2min,8000rpm 4℃离心15min,倒出酒精,重复清洗3次。
5) 室温条件下在超净工作台里风干5-10min,把管子放到冰上干燥10min,然后加入30μL DEPC水溶解,置于55-60℃ 水浴5min助溶,完成提取。保存在-80℃条件下。
质量检测
1) 使用NanoDrop ND-2000仪器测定RNA浓度和纯度(测量前先用溶解RNA用的DEPC水作为参照,调零),用于后期稀释RNA配工作液。
2) 制1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品质量,点入1μL(3-5μg均可)的RNA样品和已知浓度的Maker
3) 电泳后紫外光透射成像,根据照片中条带质量估测样品有否降解来检测RNA提取的质量
1.2.3 Small RNA提取与胶回收
1) 取上面提取的总RNA母液,根据其浓度加入DNase I(1μg RNA加入1.5U酶)除去DNA,置于37℃恒温水浴45min
2) 加入体系1/10体积的NaAc(醋酸钠,3mol/L)和2μL glycogen(糖原,10mg/ml);再加入2倍体积的无水乙醇,混匀后在-20℃条件下沉淀过夜,后在14000rpm 4℃离心30min,去除上清液
3) 在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解,静置2min,14000rpm 4℃离心10min,去上清液,得到沉淀为小分子RNA
4) 在超净工作台里风干5-10min,最后溶解在RNase-free H2O中,完成small RNA提取
5) 配置15%变性聚丙烯酰胺凝胶(凝胶需要用DEPC处理水配置)并准备电泳槽,180V预热电泳20min后清理胶孔;将small RNA在95℃下变性处理5min,后置于冰上准备点样
6) 点样时每个点样孔点入50μg的small RNA,胶面两端点25bp Marker作为参照,设置电压200V跑35min(溴酚蓝移至胶面底部时即可停止电泳)后银染
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