菜单
  

    2)    赤霉素GA3、多效唑
    3)    反转录试剂盒(Taqman. Transcription Kit 200 Reactions )
    4)    无水乙醇、氯仿、异丙醇:北京化学试剂公司
    5)    PCR引物由南京金斯瑞生物公司合成。
    6)    其他常规试剂由南京农业大学种业科学系实验室提供。
    1.2  方法
    1.2.1  赤霉素处理   
    配置GA3和PAC(paclobutrazol多效唑,赤霉素抑制剂)水溶液,浓度分别为0.1mmol/L和0.01mmol/L。挑选成熟饱满的水稻种子,培养至三叶期分为6组,分别标记为CK1、CK2、GA31、GA32、PAC1和PAC2。之后对应地分别进行整株喷施ddH2O、GA3和PAC溶液,处理24小时后挑选幼嫩叶片。取样后用DEPC处理水清洗并用灭菌纸擦干,迅速将样品放入离心管并液氮瞬时冷冻以备后续提取RNA,并将部分材料放置超低温冰箱(-80℃)保存备用。
    1.2.2  总RNA提取与质量检测   
    由于RNA非常不稳定,实验中所用的离心管、微量取样器吸头等器具均先用DEPC水处理并进行高温灭菌处理,所用研钵及各种玻璃器皿均需经过酒精灼烧,以除去RNA酶。参照Trizol试剂盒说明书进行RNA提取。
    1)    在液氮环境下用研钵研磨水稻叶片,取100mg左右粉末放入预冷的2ml的离心管中,加入1ml左右的Trizol抽提液,轻轻摇匀,室温放置10min。于-80℃冻30min以上,取出后在室温下解冻,13000rpm 4℃离心5-10min(离心机需要预冷至4℃)。
    2)    取出上清液加入200μL氯仿,轻轻上下颠倒混匀,冰上放置5-10min,13000rpm 4℃离心10min。
    3)    取出上清液加入500μL异丙醇,上下来回颠倒混匀,-20℃放置10min(使沉淀更加彻底),12000rpm 4℃离心10min,弃上清液。
    4)    在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解,静置2min,8000rpm 4℃离心15min,倒出酒精,重复清洗3次。
    5)    室温条件下在超净工作台里风干5-10min,把管子放到冰上干燥10min,然后加入30μL DEPC水溶解,置于55-60℃ 水浴5min助溶,完成提取。保存在-80℃条件下。
    质量检测   
    1)    使用NanoDrop ND-2000仪器测定RNA浓度和纯度(测量前先用溶解RNA用的DEPC水作为参照,调零),用于后期稀释RNA配工作液。
    2)    制1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品质量,点入1μL(3-5μg均可)的RNA样品和已知浓度的Maker
    3)    电泳后紫外光透射成像,根据照片中条带质量估测样品有否降解来检测RNA提取的质量

    1.2.3  Small RNA提取与胶回收   
    1)    取上面提取的总RNA母液,根据其浓度加入DNase I(1μg RNA加入1.5U酶)除去DNA,置于37℃恒温水浴45min
    2)    加入体系1/10体积的NaAc(醋酸钠,3mol/L)和2μL glycogen(糖原,10mg/ml);再加入2倍体积的无水乙醇,混匀后在-20℃条件下沉淀过夜,后在14000rpm 4℃离心30min,去除上清液
    3)    在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解,静置2min,14000rpm 4℃离心10min,去上清液,得到沉淀为小分子RNA
    4)    在超净工作台里风干5-10min,最后溶解在RNase-free H2O中,完成small RNA提取
    5)    配置15%变性聚丙烯酰胺凝胶(凝胶需要用DEPC处理水配置)并准备电泳槽,180V预热电泳20min后清理胶孔;将small RNA在95℃下变性处理5min,后置于冰上准备点样
    6)    点样时每个点样孔点入50μg的small RNA,胶面两端点25bp Marker作为参照,设置电压200V跑35min(溴酚蓝移至胶面底部时即可停止电泳)后银染
  1. 上一篇:水稻不同氮素水平下单株产量的关联分析
  2. 下一篇:大肠杆菌乳糖通透酶基因LacY的敲除
  1. 番茄逆境响应基因SlERF26的...

  2. 不同pH条件下小麦生长的生理响应研究

  3. 一次平衡法研究水稻土中...

  4. 温度胁迫对水稻种子萌发...

  5. 水稻种子无菌苗培养的条件筛选

  6. 水稻外源基因CaMV35S启动子...

  7. 水稻外源基因NPTⅡ的定性及定量检测分析

  8. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

  9. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  10. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  11. 十二层带中心支撑钢结构...

  12. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  13. 大众媒体对公共政策制定的影响

  14. 电站锅炉暖风器设计任务书

  15. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  16. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

  17. 乳业同业并购式全产业链...

  

About

751论文网手机版...

主页:http://www.751com.cn

关闭返回