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摘要: 快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组原理结合Xer重组系统开发的大肠杆菌基因删除试剂盒，可重复应用dif位点实现染色体上多基因突变的叠加, 同时, 在染色体上不会留下抗生素标记, 借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。本课题尝试利用该试剂盒删除大肠杆菌MG1655的乳糖通透酶基因，构建该突变菌株用于后续的进化生物学研究。初步结果表明：目的基因被成功敲除。28741
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毕业论文关键词：Xer重组系统； dif位点； 基因删除
Knock-out of the gene for lactose permease in Escherichia coli
Abstract：Rapid and efficient inactivation of the target gene on Escherichia coli chromosome is the precondition and groundwork of researches on metabolic engineering. In the present study, we demon-strated a multiple gene inactivation approach in E. coli mediated by Red recombination and Xer recom-bination. The chromosomal genes, ackA-pta and pps, in a wild type strain E. coli CICIM B0013 were inactivated by this method indicating that dif sites can be reused to inactivate multiple chromosomal genes with no antibiotic resistance selectable marker remain. The purpose of this project is to get E.coli Top10F'host Escherichia coli deleted from the LacY gene.
Keywords: Xer recombination,；dif sites,；Gene knock-out
目 录
1绪论 1
1.1 大肠杆菌乳糖通透酶LacY基因与乳糖操纵子 1
1.2 Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用 2
1.3 Xer重组系统及在微生物基因敲除中的应用 2
1.4 本课题的研究思路和主要研究内容 3
2 实验材料与设备 5
2.1 实验材料 5
2.1.1 主要试剂和酶类 5
2.1.2 大肠杆菌基因删除试剂盒 6
2.1.3 菌株与质粒 7
2.1.4 引物 7
2.2实验仪器和设备 7
2.3 培养基和试剂的制备 8
3 实验方法 9
3.1 细菌总DNA的提取（SDS法） 9
3.2 PCR扩增 10
3.3 电泳和切胶回收 11
3.3.1 琼脂糖凝胶电泳 11
3.3.2 琼脂糖凝胶回收 11
3.4 感受态细胞的制备 13
3.4.1 化学转化法用感受态细胞的制备 13
3.4.2 电转化法用感受态宿主大肠杆菌的制备 13
3.5 目的DNA的转化与筛选 13
3.5.1化学转化法 13
3.5.2电转化法 14
3.5.3转化后的筛选 14
3.6 提取质粒 14
3.7 质粒的酶切与重组 15
3.7.1 质粒的酶切 15
3.7.2 质粒的重组 16
3.8粘性末端的补平 17
3.9 阳性转化子的验证和庆大霉素抗性基因的去除 17
4 实验方案、结果与分析 17
4.1 实验方案 17
4.2 实验结果与分析 18
4.2.1 以MG1655总DNA为模板的PCR扩增 18
4.2.2 重组质粒的构建 19
4.2.3重组质粒的转化与筛选 19
4.2.4提取重组质粒 19
4.2.5质粒的双酶切 20
4.2.6目的条带割胶回收 21
4.2.7双酶切回收产物的补平 22
4.2.8补平产物的连接 22
4.2.9 将含突变盒基因的质粒酶切线性化 23