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以Red重组系统为基础的基因敲除是最近研究较热的技术方法,对研究微生物基因的功能具有重要的促进作用。因为它与传统的基因敲除方法相比,重组效率明显提高,Muyrers在实验中利用Red重组系统时获得的候选株80%是正确的重组子[6]。Swaminathan也在其一篇论文中阐述了利用Red重组可达到较高的成功率,而且无需采用筛选基因即可鉴定正确的重组子[7]。而且此方法利用线性打靶DNA,不需构建打靶质粒,因此实验周期大大缩短。
1.3 Xer重组系统及在微生物基因敲除中的应用
dif位点能够由大肠杆菌自身所含有的Xer重组酶进行识别[8], 因此在基因删除方法中运用dif位点取代FRT位点, 在去除抗生素抗性基因时, 不需要将携带外源重组酶基因的质粒转化于目的转化子并表达, 可以简化实验操作。然而, 迄今为止, 仅Bloor等[9]研究者报道了应用Red重组系统-Xer重组系统成功删除大肠杆菌基因组中的一个基因; 其是否适用于基因组中多基因的删除及其基因删除效率等至今未有报道。
1.4 本课题的研究思路和主要研究内容
在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成:α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35～60bp即可发生同源重组,且重组效率高。本课题的目的是将大肠杆菌Top10F'的乳糖通透酶LacY基因删除