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1994 年，查尔菲等首次在大肠杆菌细胞中表达了能发射绿色荧光的GFP，开创了GFP 研究与应用的先河[4]。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在受到紫外或蓝光激发时, 会发射出绿色荧光。存在于水母等腔肠动物体内的生物发光单体蛋白。它由238 个氨基酸组成，其分子量仅为27 kDa。所以GFP作为报告基因时，相较于以往的报告基因如LacZ、CAT等，有易于融合表达、适用于多种转化方式的优点。除此之外，GFP不具有物种专一性,可在多种异源原核和真核生物细胞中表达且无细胞毒性 [5] ；荧光强度高，稳定性好；不需要反应底物与其他辅助因子，受紫外光或蓝光激发即能产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；而且可以通过替换某些特殊氨基酸，产生不同颜色的荧光，从而满足不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有这种高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等的优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 6～7] 。
大肠杆菌作为第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[8]。而且由于其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的近30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[9]。目前最常用的外源蛋白表达系统就是大肠杆菌表达系统是,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[10]。
KRX是一种大肠杆菌K12衍生物，其具有与克隆和筛选菌株相关的显着特征，以及工程化特性以优化受控的蛋白质表达。其在成为良好克隆菌株的属性同时存在部分有缺陷的限制性系统，缺乏最常见的核酸酶。KRX还具有使其成为良好的蛋白质表达菌株的特性。 ompT-和ompP-突变消除了大肠杆菌中过表达蛋白质的蛋白水解的一个来源。
KRX包含由鼠李糖启动子（rhaPBAD）驱动的T7 RNA聚合酶基因的染色体拷贝，以提供重组蛋白表达的显着控制。 基于T7 RNA聚合酶的系统是最广泛使用的蛋白质表达系统之一，由于完全独立于大肠杆菌RNA聚合酶启动子的明确启动子。由于该系统已经使用多年，许多商业化表达载体（包括Promega Flexi等载体）用T7启动子在大肠杆菌中表达生产蛋白质。
影响荧光蛋白基因表达主要因素有很多，内因例如启动子的类型、基因的拷贝数、温度、基因旳整合位点，外因如温度、pH、实验方法等。本文针对温度和接种方法对构建于表达载体上的荧光蛋白基因表达效率进行研究。利用荧光扫描比较了整合于宿主细胞KRX染色体中的表达效率。用荧光强度度量表达、正确折叠的蛋白质水平比较不同方法和培养温度的效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
克隆菌E.coli DH-5a,表达菌KRX为本实验室收藏菌种，表达载体pRSETA质粒和EGFP编码序列来源质粒pEGFP-C1 。