1.5.2.2 操作步骤
(1)α-萘胺标准曲线的绘制:用40ug/mLα-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ug/mL,配制方法和数据如表1所示
表1 各浓度α-萘胺的配制:用40ug/mL溶液配制
浓度 5ug/mL 10ug/mL 20ug/mL 30ug/mL 40ug/mL
40ug/mLα-萘胺(mL) 5 10 20 30 40
蒸馏水 35 30 20 10 0
表2 α-萘胺标准曲线的绘制
试管号 1(对照) 2 3 4 5 6
α-萘胺(mL) 1(水) 1 1 1 1 1
磷酸缓冲液(mL) 1 1 1 1 1 1
蒸馏水(mL) 15 15 15 15 15 15
对氨基苯磺酸(mL) 1 1 1 1 1 1
100ppm亚硝酸钠(mL) 1 1 1 1 1 1
取751只试管,按表2加入各溶液并混匀,置室温(20-25度)下5分钟使之显色,最后加入蒸馏水,使整个容积为25mL,摇匀,在20~60分钟内用510nm波长进行比色,以对照光密度为0,读取光密度,以α-萘胺含量作横坐标,光密度作纵坐标绘制标准曲线。
(2)将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100mL三角瓶中,加40ug/mL的α-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25mL,混匀。
(3)静置5~10分钟后(根吸附以完毕),从瓶中取2mL溶液放入25mL容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后,放在震荡器上,在25℃下震荡3~6小时(如无震荡器时要在反应期间,定时的摇动),反应时间完毕后,再取2mL溶液放入另一刻度试管,因为α-萘胺溶液会自动氧化,所以要同时做无根的同样操作的空白试验(根样最好用整根:用切碎的根,α-萘胺溶液的氧化量会意外增加)。
(4)在上述两次及空白试验所吸取的2mL测定液中,各加入10mL蒸馏水,混匀后再加入1%对氨基苯磺酸1mL和100ug/mL的亚硝酸钠溶液1mL,混匀,置于室温下5分钟使之显色,然后加入蒸馏水,使整个容积为25mL,在20~60分钟内用510nm波长进行比色,读取光密度,由标准曲线查出α-萘胺含量。
1.5.2.3 结果计算
根系对α-萘胺的生物氧化量Y(ug•g-1•h-1)按下式进行计算
Y=[(A-B)-(C-D)]*E/(t*W)
式中:A-第一次取液测定值(ug•mL-1),作为开始值,这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应;B-第二次取液测定值,是根的酶促反应后(如3小时)剩余的α-萘胺浓度(ug•mL-1)。A-B即α-萘胺氧化总量;C-第一次空白测定值(ug•mL-1);D-第二次空白测定值;C-D即α-萘胺自发氧化量;E-稀释倍数24(48/2)(因从48mL中又取2mL);t-3小时;W-样品鲜重(也可以用干重计算)。
1.5.3 黄瓜幼苗SOD活性的测定[9-11]
1.5.3.1 试剂
(1)0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液:32.6g Na2HPO4•2H2O和2.65g NaH2PO4•2H2O用蒸馏水定容到1000mL容量瓶中。
(2)0.26mol/L甲硫氨酸溶液:称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100mL,低温避光保存,可使用1~2d。
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