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        (3)750umol/L NBT溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100mL,现配现用,低温避光保存,可使用2~3d。
        (4)100umol/L EDTA-Na2溶液:称取0.003721mg EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mL,低温避光保存,可使用8~10d。
        (5)20umol/L 的核黄素溶液:称取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至100mL,低温避光保存,现配现用。
    1.5.3.2 操作步骤
        去植物叶片(去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,加1mL磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆,倒入10mL刻度试管中,加缓冲液定容为5mL。取2mL于离心管中在10000r/min的转速下离心15min,上清液即为SOD提取液。
        每组样品都取8个洁净干燥的试管编号,按表2加入各试剂,反应系统总体积为3mL。试剂全部加入后混匀,将1号置于暗处,其余各杯均与25℃、4000lx日光灯下反应20min,各管受光情况要一致,然后立即遮光停止反应。    
     表3 各杯反应体系加入溶液量
    杯号    0.26mol/L
    Met(mL)    100umol/L EDTA-Na2(mL)    20umol/L 核黄素(mL)    酶液
    (uL)    蒸馏水(mL)
    1    0.3    0.3    0.3    0    1.8
    2    0.3    0.3    0.3    0    1.8
    3    0.3    0.3    0.3    0    1.8
    4    0.3    0.3    0.3    5    1.795
    5    0.3    0.3    0.3    10    1.79
    6    0.3    0.3    0.3    15    1.785
    7    0.3    0.3    0.3    20    1.78
    8    0.3    0.3    0.3    25    1.775
        在560nm波长下,以一号杯调零,测定其余各杯反应体系的吸光度。以2、3号对照杯OD560的平均值(A1)为参比(NBT被100%还原),分别计算不同酶液量抑制NBT光还原的相对百分率。
    1.5.3.3 计算结果
        NBT光化还原的抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A1]×100%
        式中:A1---对照杯OD560;A2----加酶杯OD560 。
        以酶液用量(uL)为横坐标,以NBT光化还原的抑制率(%)为纵坐标绘制二者相关曲线。从曲线查得NBT光化还原被抑制50%所需的酶液量(uL),作为一个一个酶活力单位(1U)。
        SOD活性(U•min-1•g-1FW)=(V×1000)/(B×W×t)
        式中:V-酶提取液总量(mL),B为一个酶活力单位的酶液量(uL),W-样品鲜重(g),t-反应时间(min)。
    1.5.4 黄瓜幼苗POD活力测定[9-11]
    1.5.4.1 试剂
        (1)0.02mol•L-1 KH2PO4溶液:称取0.272g KH2PO4溶解并用蒸馏水定容至100mL。
        (2)0.1mol•L-1 pH6.0磷酸缓冲液:称取0.438g Na2HPO4•2H2O和2.737g NaH2PO4•2H2O用蒸馏水定容到1000mL容量瓶中。
        (3)反应混合液:取0.1mol•L-1 pH6.0磷酸缓冲液50mL,加入愈创木粉0.028mL,加热搅拌,直至愈创木粉溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢0.019mL,混合均匀,于冰箱中保存。
    1.5.4.2 操作步骤
        称取1.00g洗净的植物叶片,剪碎后放入以冷冻过的研钵中,加入少量石英砂和0.02mol•L-1 KH2PO4溶液5mL,冰浴研磨成匀浆,于4000r•min-1下离心15min,上清液转入25mL容量瓶中。所剩沉淀再用5mL 0.02mol•L-1 KH2PO4溶液提取一次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,保存在冰箱中备用。
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