1材料与方法
1.1试验所需仪器
载玻片,接种针,烧杯,锥形瓶,玻璃棒,试管,隔水式恒温培养箱,天平,医用净化工作台,蒸汽高压灭菌锅,酒精灯,水浴锅,显微镜等。
1.2富集培养基
试验所需富集培养基原液及培养基配置表见表1和表2。所有溶液配置好后,储存于4℃。文生素溶液使用前需用0.22μm无菌滤膜过滤于灭菌的血清瓶中备用,两周内用完。
表1 富集培养基原液配置表
微量元素溶液:
Na4EDTA:500mg; FeSO4.7H2O:200mg;
MnCl2.4H2O:200mg; ZnSO4.7H2O:10.0g;
H3BO3:30mg; CoCl2.6H2O:20mg;
CuCl2.2H2O:1mg; NiCl2.6H2O:2mg;
FeCl3.6H2O:8.0g;
加蒸馏水至100ml 0.1%(w/v)刃天青溶液:
100mg溶解于100ml蒸馏水盐溶液 1:
K2 HPO4:1.46g;
加蒸馏水至1000ml
盐溶液2:
KH2PO4:1.46g
Na2SO4:2.4 g
NaCl:2.4g
MgSO4.7H2O:0.5g
CaCl2.2H2O:0.02g
加蒸馏水至1000ml 文生素溶液:
文生素B6:200mg ; 硫辛酸:100mg;
文生素B2:200mg; 对氨基苯甲酸:10mg;
文生素B1:200mg; 叶酸:5mg;
烟酰胺:200mg; 生物素:5mg;
泛酸:200mg; 辅酶B12:5mg;
加蒸馏水至1000ml
表2 富集培养基配置表
原液 体积/重量 原液 体积/重量
盐溶液1 200ml 微量元素溶液 10ml
盐溶液2 200ml 0.1%刃天青溶液 1ml
酪蛋白氨基酸 15g 半胱氨酸盐酸盐 0.6g
NaCO3 4g 文生素溶液 0.1ml/10ml(灭菌后添加)
加蒸馏水至1000ml
1.3继代培养及样品采集和分析
以3头安装有瘤胃瘘管的奶牛瘤胃液为接种材料,瘤胃液经过滤后(四层纱布),接入到预先预热至39℃的两种富集培养基里,每个处理四个重复,间隔24h以10%(v/v)的接种量传代一次,连续传代7次。第1-7代每次传代后立即采集24h培养物,用于吸光度和氨氮浓度的测定。使用分光光度计测定培养液吸光度,采用比色法方法测定发酵液氨态氮浓度[8],详细测定步骤如下:
A、氨氮标准系列溶液制备
① 用0.2M的盐酸溶解精确称取的0.382g氯化铵,然后定容至100ml,在冰箱中可存放数月,用作保存液,
② 用量筒量取10ml的保存液,用蒸馏水稀释定容至100ml,含氮量为10mg/100ml作为工作液。
③ 取五个编号的,50ml容量瓶,准确量取工作液0、1、2、4、6ml,接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml,使之都成为10ml,再用0.2M盐酸定容。这便是的标准系列溶液。(每100ml中含氮量分别是0、0.2、0.4、0.8、1.2mg)
B、比色与计算
① 用5个10ml的试管,精确量取标准系列溶液0.4ml,加入试管中,再在各个试管中按顺序,加入D液和E液(D液:称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml 14%水杨酸钠溶液中;E液:量取2ml次氯酸钠溶液,商品名安替福明,含活性氯5.2%),然后与100ml 0.3M氢氧化钠溶液混合,摇匀,静置10分钟之后比色。波长700nm,0.5cm的比色皿,将不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。
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