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RNA的提取:(1)RNAiso Plus裂解样品:将菌丝在液氮预冷的研钵中研磨,之后移入加有800 µL RNAiso Plus的离心管中,剧烈颠倒混匀;(2)室温静置5 min,4℃,12000 rpm,离心5 min;(3)上清转移,加入1/5体积氯仿,剧烈震荡,室温放置10 min,4℃,12000 rpm,离心15 min;(4)转移上层至新离心管,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置5 min;4℃,12000 rpm,离心10 min,弃上清。(5)加入500 µL 75%乙醇,混匀,4℃,离心5 min,弃上清;(6)冰盒干燥3 min,干燥RNA沉淀,加30 µL无RNase的水溶解,电泳检测RNA。
cDNA的制备:(1)在新的1.5 mL的离心管中加入RNA溶液17 μL,然后加入Oligo(dT) 3 μL;(2)70℃保温10 min后,冰浴10 min;离心5秒;(3)之后进行反转录。(4)42℃保温45 min;(5)95℃变性5 min,冷却,得到cDNA。
1.2.4基因表达量的测定
为了测定基因表达,将菌丝体在CYM平板上培养,然后如前所述用一层无菌玻璃纸覆盖,之后收集菌丝体并在液氮中冷冻。提取总RNA,使用持家基因18S rRNA进行基因表达的相对定量。
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