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多糖的提取率（mg/g）=CVK×10-3/W
式中：C-测量液多糖的浓度（µg/mL）；V-粗糖提取液的体积（mL）；K-粗糖提取液稀释的倍数；W-原料的干重（g）。
1.3 怀牛膝多糖提取液的抗氧化活性
1.3.1 怀牛膝多糖对超氧阴离子自由基（O2-•）清除活性
邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出超氧阴离子，生成的中间产物在紫外区有吸收。经波长扫描，在320 nm处有最大吸收。经时间扫描，该反应在4 min后趋于平缓[12]。
取两只具塞试管，各加入0.05 mol／L pH 为8.2的Tris-HCl缓冲液4.5 mL，于25℃水浴中恒温20 min，分别加入样品液2 mL和25 mmol／L的邻苯三酚溶液0.5 mL，混匀后于25℃水浴中反应5 min，加入6 mol／L HCl 1 mL终止反应，在320 nm 处测定吸光度A1，空白对照组以试样溶剂代替样品，吸光值A0。考虑样品液本身可能在320 nm处有吸收，用相同体积的样品液代替邻苯三酚，吸光值A2。每个处理均做3个重复。
超氧阴离子自由基清除率= [(A0-（A1-A2) ]／A0 ×100 % [13]
式（1）中：A1为试样的平均吸光度；A0为空白的平均吸光度。
1.3.2 怀牛膝多糖对羟自由基（•OH）清除作用[14-16]
取三支10 mL试管，各加0.2 mL 的7.5 mmol/L硫酸亚铁铵溶液、0.2 mL的7.5 mmol/L 邻二氮菲（邻菲罗啉）溶液、1.0 mL的 pH=7.4 Tris-HC1缓冲溶液，在后两支试管中，分别加入1.0 mL的 7.5 mmol/L H2O2，在三号试管中加适量样品津提液，加蒸馏水定容至10 mL，在37℃水浴锅中反应1 h，冷水冷却，以蒸馏水为对照，于508 nm波长处测定其吸光度，每个处理均做3个重复。计算清除率：
羟自由基清除率=（A样品—A损）∕(A未损—A损)×100％[17]
A样品、A未损、A损分别为加入提取液的羟自由基体系、不加H2O2及加入H2O2体系的吸光度。
2.结果与分析
2.1 不同提取方法对怀牛膝多糖提取率的影响
实验采用微波辅助提取和热水浸提法提取怀牛膝中的多糖，并以苯酚硫酸法测定多糖的含量。
图2 不同提取方法对怀牛膝多糖的提取率
由实验结果图2可知，微波辅助提取法对怀牛膝多糖的提取率较高为74.81 mg/g，热水浸提法的提取率是70.87 mg/g。由于热水浸提的缺点是提取温度高，耗时长且效率低，成本高，安全性低。而微波辅助法的热效率高，温度升高快速而均匀，且微波的频率很高，能深入渗透物体，对细胞的结构有较大作用。因此，应用微波辅助提取手段，能够显著缩短提取时间，较大程度地提高多糖的提取效率[18-19]。
2.2 怀牛膝多糖提取液的抗氧化活性
本研究采用分光光度法测定怀牛膝多糖提取液的抗自由基活性，其抗氧化活性结果如图3、4。
图3 怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基的清除率
图4 怀牛膝多糖提取液对羟自由基的清除率
由实验结果图3、4可知：微波辅助提取液对超氧阴离子自由基的清除率为70.48%，对羟自由基的清除率为45.54%。热水浸提液对超氧阴离子自由基的清除率为68.34%，对羟自由基的清除率为40.44%。
由上述数据可知多糖提取物均有较强的抗氧化活性，其中微波辅助提取的抗羟基自由基和抗超氧自由基较强。在实验浓度范围内，怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子和羟自由基均有明显的清除效果。其原因可能是多糖分子上具有还原性的半醛酸羟基，可与活性氧发生氧化还原反应[20]所致。
3.结论
本实验采用微波辅助提取（料液比1:20，浸提温度80℃，提前浸泡2 h，微波功率中高火，微波1 min）和热水浸提（料液比1:20，浸提温度80℃，浸泡24 h）两种方法，提取怀牛膝中的多糖，并采用苯酚硫酸法测定多糖的含量。同时，测定怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基（O2-•）和羟自由基（•OH）的清除率。由实验结果可知，微波辅助法对怀牛膝多糖的提取率为74.81 mg/g，高于热水浸提法的提取率70.87 mg/g。且怀牛膝多糖提取液具有较好的抗氧化活性，对各种形式的活性氧均有明显的清除作用。微波辅助提取液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别为70.48%、45.54%。热水浸提液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别为68.34%、40.44%。