仪器设备:高效液相色谱仪为Agilent 1260 和 Agilent G6410B,色谱柱为XDB-C18 (4.6×250 mm, Agilent)。灭菌锅、振荡培养箱、水环氏真空泵、旋转蒸发仪、冷冻干燥机、分析天平。
耗材:Millipore Millex-GP针头滤器 孔径0.22μm、一次性注射器。
1.2 方法
1.2.1 发酵液制备
将保存在-80°C甘油管的SQR9和突变体ΔysnE菌种在LB固体培养基平板划线活化,37 °C培养箱过夜培养直至长出单菌落。分别挑取SQR9和突变体ΔysnE的单菌落接种于3 ml液体LB试管中,37 °C,170 r min-1震荡培养至对数期(OD600=0.6),然后以1%接种量接种于100mL LB液体培养基的锥形瓶中培养至对数期,低速离心菌体并用无菌水洗3次后重悬菌液至OD600=0.5,发酵备用。
解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE分别以1% 接种量分别接种于浓度为0.5 mM的色氨酸(TRP)、吲哚乙醇(TOL)、 吲哚乙腈(IAN)、色胺(TAM)、吲哚丙酮酸(IPA)和吲哚乙酰胺(IAM)的200 ml Landy培养基中,22 °C,100 r min-1避光培养96h,并连续测定生长曲线(其中,色氨酸(TRP)、吲哚乙醇(TOL)、 吲哚乙腈(IAN)、色胺(TAM)、吲哚丙酮酸(IPA)和吲哚乙酰胺(IAM)过孔径0.22μm 为Millipore Millex-GP针头滤器除菌)。
1.2.2 发酵液样品处理
将上述解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE的100 ml发酵液10,000 r min-1,4 °C离心10 min,去除菌体,将上清转移至分液漏斗中,加入等体积的乙酸乙酯剧烈震荡10min,10,000 r min-1,4°C离心10 min,转移乙酸乙酯层于烧瓶中,下层萃取三次,合并乙酸乙酯于烧瓶中。37°C水浴,旋转蒸发有机相近干,用1 ml甲醇溶解,过0.22 μm滤膜,放入-20 °C冰箱保存,供HPLC定量分析。
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