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图13 CmBBX24和CmBBX22互作验证.15
酵母双杂交筛选菊花CmBBX22和CmBBX24互作蛋白的研究
引言：菊花（Chrysanthemum morifolium）为菊科菊属多年生宿根草本，是世界四大切花之一，也是我国十大传统名花。其具有很高的观赏和经济价值，可食用、泡茶、药用等。
1989年，Fields[1]和Song提出并创立了一种直接用于酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学新方法一酵母双杂交系统。酵母双杂交系统的基础是真核生物调控转录起始过程，参与转录调控的转录激活因子在结构上是组件式的，由两个或两个以上相对独立的结构域组成：DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录活化结构域(activition domain，AD)。两个结构域相互作用产生空间联系是转录激活的关键，而两者单独作用则无法激活转录过程。这一技术在细胞周期与分化、细胞凋亡、信号转导、癌基因产物功能、基因表达调控及蛋白自身特性等研究领域[2]受到越来越多的关注。
目前，酵母双杂交技术在菊花方面的应用不多，楼望淮[3]等根据已报道植物的eIF4E序列设计引物，采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因，荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性，并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。其互作蛋白中其中包括蛋白翻译和翻译后修饰、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。楼望淮等[4]用酵母双杂交技术筛选菊花cDNA文库初步得到了与CVB外壳蛋白相互作用的E3泛素连接酶ARIADNE-like蛋白和ATP结合蛋白，为进一步研究CVB外壳蛋白与寄主的互作机制奠定了基础。
BBX蛋白是一组锌指转录因子，包含一个或两个B-Box基序，有的具有CCT结构域。BBX蛋白是生长及发育阶段调控网络中的关键因子，如在苗期形态建成，光周期调控成花，避阴反应及生物和非生物的胁迫中发挥作用。在拟南芥中，B-Box家族包含32个蛋白成员[5]。在拟南芥中，利用人工干扰技术降低BBX19的表达水平，能够使拟南芥早花，而组成型表达BBX19能够使拟南芥在诱导光周期下延迟开花[6]。而这种延迟开花并未伴随CO表达水平的改变，但却降低了FT的转录水平及FT调控基因SOC1，LEY，FUL。BBX19与CO能够发生相互作用并共定位在核中。bbx4突变体在SD和LD条件下表现早花，这表明BBX4在开花中与CO扮演截然相反的角色[7]；在诱导的LD条件下，超表达BBX7能够通过降低CO表达量进而减少FT的表达来延迟开花[8]；bbx6突变体植株在SD条件下开花时间正常，而BBX6-OX植株能够通过促使FT表达来诱导早花[9]。在拟南芥中，BBX22通过HY5传达光信号来激活三种主要的光形态建成：抑制下胚轴伸长，花青素的合成和叶绿体的发育。在光形态建成中，BBX22的瞬时积累使其作为正调控因子的功能得以实现，在短日照下，BBX22蛋白积累较高的水平，起到抑制下胚轴伸长的作用[10]。
在模式植物拟南芥中，已有研究表明超表达BBX24（STO）能够促使拟南芥在长日照和短日照下均提早开花，而敲除BBX24（STO）则只能在短日照下延迟野生型开花；BBX24除了与开花时间有关外，还与植物的抗性有关[11]。在菊花中，CmBBX24至少具有两个功能：一是调控开花时间和非生物胁迫抗性，二是影响赤霉素的生物合成[12]。但具体的机制并不清楚。之前已从‘神马’菊花的花芽分化文库中筛选到可能与CmBBX24互作的蛋白CmBBX22。现以‘神马’菊花的叶片为材料，提取mRNA，通过RT-PCR、3'-RACE和5'-RACE扩增克隆基因，得到CmBBX22的全长；然后进行载体的构建及转录激活功能的验证，最后运用酵母双杂系统验证CmBBX24与CmBBX22存在互作。本研究可为CmBBX24及互作蛋白转基因菊花功能的分析奠定基础，为菊花花期及抗逆新品种的培育提供候选基因。