2.2.3 Sephadex G-25 凝胶层析测定多肽分子量[10]
(1) 实验原理
凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,而后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。
操作步骤:
① 凝胶的处理
Sephadex G-25干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h,或沸水浴中3h,这样可大大缩短溶胀时间,而且还可杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。凝胶颗粒要求大小均匀,可是流速稳定。凝胶充分溶胀后用可将不易沉下的较细颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干,用10倍体积的洗脱液处理约1h,搅拌后继续用该法除去悬浮的较细颗粒。
② 装柱
将层析柱垂直装好,关闭出口,加入洗脱液约1cm 高。将处理好的凝胶用等体积的洗脱剂搅成浆状,自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中,待底部凝胶沉积约1cm 高时,再打开出口,继续加入凝胶浆,凝胶沉积至一定高度(约70cm)即可。装柱要求连续、均匀、无气泡和无“纹路”。
③ 平衡
将洗脱剂与恒流泵相连,恒流泵出口端与层析柱入口相连,用2~3倍床体积的洗脱剂平衡,流速为1mL/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸,以防加样时凝胶被冲起。
柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖—2000检查层析行为,在层析柱内加1mL(2mg/mL)蓝色葡聚糖—2000,然后洗脱,流速为1mL/min,若色带狭窄并均匀下降,说明装柱良好,然后再用2倍床体积的洗脱剂平衡。
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