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    第三章 克隆载体的构建

       从蝌蚪视顶盖获取目的基因—HDAC1,经RNA提取、逆转录成cDNA模板`751^文:论;文'网www.751com.cn,cDNA经PCR扩增回收后连接PTA2克隆载体,转化抽提后筛选重组子进行酶切、测序鉴定其准确性。

    3.1材料

    PTA2空载、KOD Plus 、TA克隆试剂盒(日本TOYOBO公司);感受态菌株E.cori Top 10(-80°C保存);RNA抽提、凝胶回收试剂盒(美国Axygen公司);DM5000 DNA Marker、质粒小抽试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);逆转录酶(美国BIO-RAD公司);限制性内切酶、T4连接试剂盒(美国Thermal公司);Trptone、Yeast Extract、Nacl、Agar(上海生工生物技术有限公司);3-氨基-苯甲酸乙酯(MS222)(意大利Sigma-Aldrich公司)

    主要仪器

       连续变倍体视显微镜:SMZ1500 Nikon(苏州欧米特光电科技有限公司)小型离心机(Eppendorf centrifuge 5424);PCR仪(BIO-RAD C1000 Touch TM Thermal cycler);凝胶成像系统(BIO-RAD GelDoc XR+Gel Imaging System);细菌培养箱(美国Thermal公司);超净工作台(上海博讯 SW-CJ-2FD)

    自配试剂:

    MS222:500mL Steinberg’s Solution和0.1g MS222 powder混匀,调节pH至7.4。

    3.2 方法

    蝌蚪用0.02%的MS-222进行麻醉后,收集视顶盖,提取总RNA(详细步骤参考Axrgen公司Axy Prep Mulitisoure Total RNA Miniprep Kit的说明书),电泳鉴定RNA质量后,将RNA逆转录成cDNA,对所获cDNA模板进行PCR扩增。

    引物序列(由Primer Primer 5.0软件设计,上海生工生物技术有限公司合成):

    HDAC1 F:CGG AAT TCA TGG CGC TGA GTC AAG GAA C

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