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摘要：磷酸盐的去除是污水处理的关键步骤。细菌细胞表面展示技术的应用，可将磷酸盐吸附蛋白表达于细胞表面，从而克服细胞对磷摄入量的限制，做到高效除磷。本研究通过设计合适的引物，用PCR的方法扩增得到大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白编码基因phoS，将inaQ-N与phoS融合并插入相应大肠杆菌表达载体，构建inaQ-N-phoS大肠杆菌细胞表面展示体系，即以InaQ-N为载体蛋白将具有磷酸盐吸附能力的磷酸盐吸附蛋白PBP展示于大肠杆菌细胞表面。结果表明，构建的细胞表面展示系统能有效吸附溶液中的磷酸盐。6896
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关键词： 磷酸盐;大肠杆菌;细胞表面展示
Functional cell surface display of phosphate binding protein using Ice nucleation protein
Abstract: Phosphate removal is a key step in wastewater treatment. The phsophate binding protein (PBP) can be displayed on the cell surface by the construction of bacterial cell surface display system. This method can overcome the limitation of phosphate intake by cells. In this study, a phosphate binding protein encoding gene named phoS from Escherichia coli was cloned by PCR. Then, the inaQ-N and phoS gene was fused and inserted into the plasmid. The PBP can be displayed on the bacterial surface using InaQ-N as carrier protein. The results in this study showed that the concentration of phosphate was reduced by biosorption of this cell surface display system.
Keywords: phosphate binding protein; E. coli; cell surface display
目录
1 前言 3
1.1细胞表面展示技术概述 3
1.1.1 细胞表面简介 3
1.1.2 细胞表面展示概述 3
1.1.3 细胞表面展示体系概述 4
1.1.4 细胞表面展示技术的应用 4
1.2 磷酸盐吸附概述 6
2 本课题的研究目的和意义 7
3材料试剂、仪器设备和方法、技术 7
3.1材料试剂、仪器设备 7
3.1.1菌株与质粒 7
3.1.2 培养基配方及培养条件 7
3.1.3试剂 8
3.2方法、技术 9
3.2.1大肠杆菌质粒DNA的提取 9
3.2.2 引物设计 10
3.2.3 PCR扩增目的基因片段phoS 10
3.2.4 PCR产物的连接 11
3.2.5 转化pMD19T-phos重组菌 11
3.2.6 验证目的基因是否转化成功 11
3.2.7 酶切与连接 12
3.2.8琼脂糖凝胶电泳 13
3.2.9磷酸盐浓度测定 13
4 结果分析 15
4.1 pTrcHisC-inpN-gfp基因质粒的提取 15
4.2 phos基因的PCR扩增 16
4.3含pMD-19T-phos质粒的重组菌验证 16
4.4 pTrcHisC-inpN-phoS重组质粒的鉴定 17
4.5 磷酸盐总浓度标准曲线的测定 21
4.6 磷酸盐吸附试验结果 21
5 讨论 22
6 总结 22
1 前言
1.1细胞表面展示技术概述
1.1.1 细胞表面简介
细胞表面是细胞内外的功能界面，是细胞与细胞外环境的边界。在结构上包括细胞被（cell coat）和细胞质膜。动、植物细胞间的连接结构、细菌与植物细胞的细胞壁以及表面的特化的结构，如鞭毛等都可看成是细胞表面结构的组成部分。在功能上，细胞表面是细胞质膜功能的扩展，它保护细胞，使细胞有一个相对稳定的内环境；负责细胞内外的物质交换和能量交换，并通过表面结构进行细胞识别、信息的接收和传递、进行细胞运动，以及文护细胞的各种形态，并且与免疫、癌变都有十分密切的关系。一些表面蛋白横穿过质膜, 另一些以共价或非共价结构与细胞表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面蛋白, 并且能将其限制在细胞表面的特定区域。在生物技术中, 细胞表面通常用于研究蛋白跨膜的机理。通过建立在微生物细胞表面展示外源蛋白的系统, 可以用来分离多肽; 生产生物催化剂、全细胞的吸附剂和活体疫苗;并且可以筛选异源或者修饰蛋白[9]。