菜单
  

    2)检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。
    3)检查Buffer P2和P3是否出现沉淀。
    (2)取1.5~5ml 过夜培养的菌液,8000×g离心2 min,收集菌体,弃尽培养基。
    (3)在沉淀中加入250ul Buffer P1彻底悬浮菌体。
    (4)加入250ul Buffer P2 立即温和颠倒离心管5~10次混匀,室温静置2~4 min。
    (5)加入350ul Buffer P3立即温和颠倒离心管5~10次混匀。
    12000×g离心5~10分钟,将上清液移入吸附柱,8000×g离心30秒,倒掉收集管中的液体。
    (6)(选做)加入500ul Buffer DW1,9000×g离心30秒,倒掉收集管中的液体。
    (7)加入500ul Wash Solution,9000×g离心30秒,倒掉收集管中的液体。
    (8)重复步骤(7)一次。
    (9)空吸附柱于9000×g离心1 min。
    (10)将吸附柱放入一个干净的1.5 ml离心管中,在吸附膜中央加入50~100ul Elution Buffer室温静置1 min后,离心1 min,保存管中DNA溶液。
    将上述步骤提取出的DNA溶液上样5 ul于0.8%琼脂糖凝胶,电泳验证。
    (B)减法提取质粒,步骤如下:
    (1)取l.5 mL培养好的新鲜菌液于l.5 mL Eppendorf管中,10,000rpm离心l min,收集菌体。
    (2)加入100 uL溶液I,充分悬浮菌体。
    (3)加入200uL新配置的,混匀,置冰上反应5 min。
    (4)加入150 uL溶液III,冰上反应5 min,12,000 rpm离心5 min,取上清至一干净Eppendorf管中。
    (5)加入等体积的溶液IV,混匀,12,000 rpm离心5 min,将上层水相转移至另一干净Eppnedorf管中。
    (6)加2倍体积冷无水乙醇,混匀,室温下静置10 min,12,000 rpm离心l0 min,弃上清,干燥后溶于20 uL TEbueffr。
    将上述步骤提取出的DNA溶液上样5 ul于0.8%琼脂糖凝胶,电泳验证。
    3.2.2 引物设计
    表1   PCR反应引物
    引物名称
    Primer    序列(5’端~3’端)
    Sequence(5’~3’)
    Phos1    GGAAGATCTGAAGCAAGCCTGACAG
    BglII
    Phos2    CCGGAATTCTTAGTACAGCGGCTTA
    EcoRI
    a) 引物中引入的酶切位点用下划线标出
    3.2.3 PCR扩增目的基因片段phoS
    对磷酸盐吸附蛋白编码基因进行菌落PCR,PCR所加试剂见表2,所用菌为JM109。PCR的反应体系为94℃ 3 min,(94℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 45 s) ×30,72℃ 10 min,4℃ ∞。将得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳验证。
    表2 PCR反应试剂
    试剂    Phos扩增/ul    空白对照/ul
    10×buffer    2.5    2.5
    primer    2×1.0    2×1.0
    Mg2+    1.5    1.5
    dNTP    1.0    1.0
    dH2O    17.0    17.5
    质粒    0.5    不加
    Taq酶    0.5    0.5
    3.2.4 PCR产物的连接
    表3 PCR产物连接试剂
    试剂    用量/ul
    pMD-19T    1
    phos    1
    d2H2O    3
    Total    5
    恒温16℃放置2h以上或4℃过夜。
    3.2.5 转化pMD19T-phos重组菌
    转化(transformation)是将一种生物(供体)的遗传物质(通常为DNA)转入另一种生物(受体)并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌,在低温(0~5 ℃)环境下经CaCl2处理,细胞壁变松变软后能摄入外源DNA,这种状态称为感受态细胞(competent cell)。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42 ℃短时间的热激可利于外源DNA转化,然后再经过恢复和筛选,选择转化子。
    (1)挑取JM109单菌落接种于液体LB培养基,37℃ 180 r/min振摇培养过夜。
  1. 上一篇:复合菌剂对有机磷农药毒害小麦的缓解作用
  2. 下一篇:菟丝子的化学成分研究+文献综述
  1. 降解羽毛蛋白菌株的筛选及初步鉴定

  2. 细胞膜-细胞骨架连接蛋白...

  3. 低pH环境下小麦生长发育的蛋白表达变化研究

  4. 饥饿对鲫鱼背部肌肉水分...

  5. 在前导肽引入N-糖基化位点...

  6. 肝素钠废水中蛋白质降解菌筛选与鉴定

  7. 饥饿对小龙虾腹部肌肉水...

  8. 十二层带中心支撑钢结构...

  9. 杂拟谷盗体内共生菌沃尔...

  10. java+mysql车辆管理系统的设计+源代码

  11. 中考体育项目与体育教学合理结合的研究

  12. 乳业同业并购式全产业链...

  13. 当代大学生慈善意识研究+文献综述

  14. 大众媒体对公共政策制定的影响

  15. 河岸冲刷和泥沙淤积的监测国内外研究现状

  16. 酸性水汽提装置总汽提塔设计+CAD图纸

  17. 电站锅炉暖风器设计任务书

  

About

751论文网手机版...

主页:http://www.751com.cn

关闭返回