水稻早衰突变体FG35的图位克隆

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摘要水稻是我国重要的粮食作物，其高产稳产是我国长治久安和可持续发展的重要保障。水稻发生早衰现象表现为抽穗期开始出现发黄衰老症状，以叶尖和叶缘尤其严重，至抽穗期表现为严重早衰，出现育性下降。通过对水稻衰老相关基因的克隆和功能研究, 揭示其遗传调控机制, 为培育和创制抗衰老水稻作物创造条件。本次实验利用EMS诱变获得的水稻根突变体群体FG35开展性状鉴定筛选、基因图位克隆等研究。结果发现，OsFG35在其gDNA序列的2907bp 位置由G变成了A，导致编码的氨基酸中一个天冬氨酸变成了络氨酸。因此，我们初步推测这个ORF可能为FG35的候选基因。研究控制水稻早衰的基因无论对于基础理论研究还是生产实践都具有重要意义。44183

Paddy rice is an important food crop in China and its high and stable yield is the important guarantee of the long-term peace and order as well as the sustainable development of China. Its premature senility is characterized by yellow symptoms of aging in heading stage, particularly serious blade tip, severe premature aging at heading stage and fertility decline. Through the studies on the cloning and functions of aging-related gene of paddy rice, their genetic regulatory mechanism is revealed; conditions are created for the cultivation and development of anti-aging paddy rice crop. The experiment uses paddy rice root mutant group FG35 obtained by EMS mutagenesis to conduct character identification, screening and map-based gene cloning research. According to the findings, for OsFG35, 2907 bp position in the gDNA sequence turns to A from G, making the encoding aspartic acid in amino acids become into tyrosine. Therefore, it is preliminarily presumed that the ORF may be the candidate gene of FG35. The research of paddy rice premature senility genes control has important significance for the basic theory researches and the production practice.

毕业论文关键词：基因;图位克隆;叶;水稻;定位

Keyword: Gene；Map based cloning；Leaf；Rice; Location

第一部分——引言.4

第二部分

1.1实验材料来源与介绍.5

1.2定位群体的构建和水稻水培法营养液配方表..5

2.1.1 水稻DNA的SDS提取方法.5

2.1.2 鼎国植物基因组提取试剂盒提取水稻DNA方法.6

2.2 SSR标记的开发及引物设计..6

2.3 分子标记检测.6

2.4 基因定位方法.7

2.5 水稻基因组重测序及候选基因的预测..7

2.6 琼脂糖胶回收和纯化.8

第三部分——实验结论与分析

3.1FG35表型分析..8

3.2 FG35基因初定位..9

3.3 FG35基因精细定位..10

3.4 FG35候选基因的鉴定10

3.5.早衰突变体研究意义及展望11

参考文献..11

致谢12

引言水稻是我国重要的粮食作物，其高产稳产是我国长治久安和可持续健康发展的保障。水稻籽粒中的干物质绝大部分来自于叶片的光合作用，叶片是植物光合作用的最主要的器官，对植物的生长发育和后期干物质的积累起重要作用。所以维持水稻的正常生长发育，保证叶片中叶绿素的含量，才能保证叶片的光合效率，促进水稻增产增收具有重要意义。当处于逆境时, 为使种质得以延续, 植物也会产生一种程序性细胞死亡的叶片衰老。叶片早衰通常会导致水稻灌浆不足、结实率下降、千粒重变小等. 在一些杂交稻组合中, 功能叶过早衰老直接缩短了叶片的光合作用能力, 导致光合产物积累的减少, 进而影响水稻的产量。相反, 延缓水稻叶片的衰老, 则提高水稻产量。因此, 通过对水稻叶片衰老相关基因的克隆和功能研究, 揭示其遗传调控机制, 对于培育和创制抗衰老水稻品种具有重要的意义。查阅国内相关文献资料已知目前已从不同植物类群中克隆出30 多种衰老相关基因(SAG), 模式植物拟南芥中克隆并且功能鉴定的基因包括WRKY/NAC 转录因子、水解蛋白酶、酰基转移酶、生长素响应因子, 对揭示植物叶片衰老机理,理解整个复杂的衰老调控网络具有重要作用。水稻中已克隆了8 个SAGs, 其中6 个表达上升, 即Os12,Osh69, sgr(t), SGR, sgr, nyc1, 2 个表达下降, 即OsDos和ygl1. Os12 和Osh69 用抑制差减杂交法从衰老的水稻叶片中筛选所得, 分别编码GABA 转氨基酶和碱性α-半乳糖苷酶, 在衰老时期的叶片中特异表达, 在茎杆和根里几乎不表达。GABA 转氨基酶为线粒体GABA 支路的关键酶, 与脯氨酸代谢息息相关, 在水稻叶老化时碳氮代谢中扮演重要角色, 此酶亦可防止ROS 之堆积, 故在植物防御机制中也具有重要作用。 OsDos 编码CCCH-型锌指蛋白, 在叶片衰老和幼穗分化时期表达下降,OsDos 干涉后植株营养生长时期表现正常, 抽穗晚期叶片黄化速率加快, 到谷粒充实期, 除剑叶还保持一定绿色外, 其他的叶片都已衰老。另外一个下调基因ygl1 是通过图位克隆得到的, 其突变使得叶绿体水稻的衰老，尤其是叶片早衰，与作物减产密切相关。而这就需要我们对水稻早衰发生的生物代谢极其调控机制进行深入的研究和了解。目前，水稻中只有少数的与早衰相关的基因被发现，进行了定位和图位克隆，多数的水稻早衰基因还有待挖掘。早衰突变体资源丰富，该突变体主要表现为苗期叶片开始黄化，叶绿素含量显著降低，发黄的叶片与野生型相比很容易区分，在苗期进行筛选时可以很容易用黄枪头标记出。有研究表明，水稻叶片延迟一天衰老，理论上可使水稻产量增加2%左右，实际上增产1%左右。尽管对水稻早衰做了大量的研究，但具体的分子调控机制尚不清楚。水稻作为重要的粮食作物，同时也是单子叶植物的模式植物，研究水稻早衰机制对水稻育种和解释植物早衰调控机制具有重要意义。正常生长条件下，水稻叶片衰老是一个主动的过程。水稻叶片衰老是一种细胞程序性死亡，是长期进化过程中形成的适应性，具有重要的生物学意义。而早衰是水稻生育后期代谢机能过早衰退的一种生理现象。关于植物衰老的成因，几十年来国内外从叶片的形态结构、生理特性等角度进行了大量的研究，并提出了营养亏缺、植物激素、活性氧代谢、死亡因子、差误理论、光周期以及衰老基因等多种假说。植物叶片在衰老过程中，经历了一系列物质、形态的变化，叶绿素下降，蛋白质含量下降，水解酶含量增加，活性增强，自由基和活性氧清除酶类含量增加等。目前，对控制植物衰老基因的研究已有不少，在拟南芥、玉米、大麦等许多植物中已经克隆出与叶片衰老相关的基因。在拟南芥中已发现多个调控衰老的基因，其中，ATAPG、ATAPG9、HYS1和OLD1为加速叶片衰老的基因，OIN3、ORE1、ORE4和ORE9可以延迟叶片的衰老。研究人员在水稻中已经定位和克隆了大量的衰老相关基因（senescence-associated genes，SAGs），但直接调控衰老的基因克隆较少，主要有Os12、Osh69、Sgr(t)、SGR、Sgr、NYC1、OsDos、YGL1和SPL28，定位的早衰基因主要有Psl1、Pse(t)、Sms1、Psl3和Es-t等。叶片衰老涉及基因类型多、参与细胞代谢途径也多。而且，在不同诱导因素下，调控基因的数量也会改变，遗传机制极为复杂。目前，早衰基因克隆较少，在籼稻中，早衰基因主要集中于表型鉴定和遗传分析，尚未发现在籼稻背下克隆的早衰基因。本研究以籼稻品种蜀恢经ＥＭＳ诱变产生的一个早衰突变体FG35为材料，详细描述了该突变体的形态学特征、生理学特性，并对该突变基因进行了精细定位，通过图位克隆的方法分离克隆OSFG35基因，以期为该基因功能研究及应用提供理论依据。