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2.4.3 T载体连接和大肠杆菌转化 8
2.4.4大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定 8
2.4.5 终载体连接 9
2.4.6筛选重组质粒 9
2.5 Clps各组分蛋白的原核表达及纯化 9
2.6 pull-down技术 10
2.7蛋白凝胶电泳 10
2.8 western免疫印记 11
3 结果与分析 11
3.1Clps蛋白酶亚基基因表达载体构建概况 12
3.2 Clps各组分蛋白的原核表达及纯化 13
3.3 Pull-down验证Clps蛋白酶亚基之间的相互作用 14
4 小结与讨论 14
参考文献 15
致谢 16
引言我国是世界上人口第一大国，但是人均耕地面积远远小于世界平均水平，因此我国面临非常巨大的粮食压力。水稻是我国主要粮食作物，目前随着我国经济社会的不断发展，水稻种植面积较早年有大幅度减少，已严重影响到我国的粮食安全。而增加水稻的光合产量是实现水稻增产的一个根本途径。研究表明，目前我国水稻的光能利用率不到2%[1]，理论上植物对光能的利用率是13%-15%，理想的水稻光能利用率应达5%，所以增产潜力较大。叶绿体是植物细胞进行光合作用的场所，其正常发育是作物获得光合产量的前提[2-4]。因此对作物叶绿体生物合成及其相关调控机制的深入解析将有助于我们认识叶绿体的发育过程，为从根本上提高作物的光合效率提供理论支持及新思路。
近年来，随着现代分子生物学的发展，植物叶绿体的生物合成及其发育过程正在逐步解析。ATP依赖的酪氨酸水解蛋白酶（ATP-dependent caseinolytic protease，Clp）是目前发现的一类与植物质体发育相关的重要看家酶类，为水解蛋白酶复合体，调控植物质体蛋白的生物代谢，对质体的生物合成和发育具有重要的作用。叶绿体是植物细胞中最重要的一种质体，其生物合成及植物的生长发育同样受到叶绿体Clps的调控[5-6]。
高等植物质体酪氨酸水解蛋白酶(Clps) 复合体家族成员较为庞大，在模式植物拟南芥中，Clps主要是由中心复合体和热休克蛋白两个部分组成，中心复合体主要包含两种类型的蛋白：Pring类型蛋白和Rring类型的蛋白。Pring蛋白主要包括Clpp3、Clpp4、Clpp5和Clpp6，这4种蛋白的比例是1:2:3:1。Rring蛋白主要包括Clpp1、ClpR1、ClpR2，ClpR3，他们的比例是3:1:1:1:1[9-10]。热休克蛋白主要由3种类型的蛋白组成，3个ClpAAA+分子伴侣、2个特异性的植物组分（ClpT1、ClpT2）以及受体蛋白ClpS。除ClpP1由叶绿体基因组编码外，其余Clps亚基均由核基因组编码并通过胞内运输进入叶绿体，进而参与叶绿体的生物合成。这在部分双子叶植物研究中已经得到证实，单个或多个Clps蛋白酶亚基的不表达或低表达均显著影响植物叶绿体的发育，引起植物失绿，生长受抑制甚至致死[9-12]。
目前，植物叶绿体Clps复合体在单子叶植物特别是水稻等重要农作物中的研究仍相对较少。Dong et al（2013）通过图位克隆方法分离获得一个水稻黄绿叶突变体vyl基因，发现该基因编码蛋白为拟南芥Clp蛋白酶亚基ClpP6在水稻中的同源蛋白，是叶绿体Clp蛋白酶的亚基之一，能与Clp蛋白酶亚基OsClpP3和OsClpP4分别互作，初步揭示了Clps复合体在水稻叶绿体生物合成中的作用。但是对植物质体Clps蛋白酶亚基在水稻叶绿体生物合成和发育过程中的调控机制及互作关系还有待进一步研究。同时，植物质体Clps蛋白酶亚基的装配及互作调控过程仍不清楚，特别是在单子叶作物中，相关研究更是匮乏。