基于热不稳定和热稳定核酸酶序列比对的定点突变研究(2)

菜单

引言

核酸酶是一类能够降解DNA或RNA的酶，它是通过水解核苷酸之间的磷酸二酯键来起作用的。在高等动植物中都存在核酸酶，有一类特殊的核酸酶时非特异性的核酸酶，它的用途非常广泛，在遗传机制方面，细胞凋亡和肿瘤治疗等，不仅具有非特异性，而且具有热稳定性[1-2]。从第一种核酸酶（DNase I）发现至今已有100多年的历史，但人们对核酸酶的生物学作用、作用机制和生物学意义始终不很清楚。目前，有关核酸酶及其生物学意义的研究主要集中在其在消化吸收中的作用，以及与某些特殊临床疾病之间的关系等方面[3-5]。

基因的定点突变是指按照人为的要求，使基因的特定序列发生重排、插入、缺失、置换等。体外的定点突变技术是来研究蛋白质之间结构和功能关系的有效工具。基因定点定点突变和置换技术具有巨大的应用潜力，世界各国科学家投入大量研究，比如一些成功的例子：利用寡核苷酸介导单碱基置换（插入或缺失）等[6-9]。基因定点突变与置换技术将在核酸酶热稳定性方面发挥极其重要的作用，基因定点突变技术在基因组原位改变基因特定序列，避免常规转基因过程中位置效应和插入失活[10-11]。定点突变生物体是自身部分基因的改变，而不含有转基因或标记基因，所以没有太大的风险性。核酸酶基因定点突变的研究初见端倪，将可能为基因原位功能研究、作物疾病的和分子设计提供有效策略[12]。有文献数据，基因的定点突变无论在基础研究还是在动植物和微生物应用研究方面都具有重要意义[13-15]。相信随着研究的不断深入，这一技术的应用必将越来越广泛。

定点突变技术是酶工程中采用的重要技术之一，近年来这项技术得到了广泛的应用，而由于定点突变技术是与已知酶的空间结构和功能关系有关的，所以通常是将酶蛋白的功能结构分析和定点突变结合起来的。如，Mahdieh等[16]通过拉式图分析软骨素酶ABCⅠ的构象，发现140位置处的谷氨酰胺没有最佳的Φ和Ψ值，故用定点突变的方法将其突变为甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺。众多关于定点突变的实验文章中，表明体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系的有力工具，由于蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列、蛋白质结构和功能，为此定点突变技术得到了广泛应用[17]。常用于研究蛋白质相互作用位点的结构特征，酶活性的改造或者酶动力学反应特性研究[18-20]，蛋白的活性、稳定性、抗原性等特性的提升，蛋白三维晶体结构测定，疾病致病机理的研究和治疗等方面有着重要的作用[21-26]。

我们都知道酶在医药、食品、化工和环境保护等许多领域具有广泛的用途，但由于酶不稳定使其大规模开发利用受到限制。它是指酶蛋白在没有底物存在时在一定温度下保温储藏一定时间后酶保持稳定性和生物活性的能力，酶的稳定性涉及多个方面，其中热稳定性是酶重要的属性之一。有研究表明，天然存在的低温酶在低温下具有高度的催化作用，但是热稳定性一般较差，不利于工业应用。故而为了保证核酸酶的高效利用率，提高酶的热稳定性是一种有效的措施[27-28]，目前，提高酶的热稳定性有很多方法，但比较普遍的是采用定点突变的方法，结合酶的空间结构，选择适当的突变位点，有目的地改善酶的活性的热稳定性。

本实验首先利用生物学软件NCBI在线Blast工具序列比对热不稳定Y.e.e（Y.enterocolitica subsp. enterocolitica）和热稳定Y.e.p（Y.enterocolitica subsp.palearctica）非特异性核酸酶的氨基酸序列，再用定点突变方法突变后分析突变体的酶的活性和热稳定性，从而推测影响Y.e.p非特异性核酸酶的酶活性和热稳定性的关键氨基酸残基。