基于热不稳定和热稳定核酸酶序列比对的定点突变研究(3)

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1材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒

重组质粒pET24a-nuc 由本实验室保藏

大肠杆菌E.coli DH5α 购自北京GenStar 公司

大肠杆菌BL21starTM（DE3）plysS 购自Novagen 公司

1.1.2 酶与试剂盒

甲基化酶Dpn I、DNA Marker、BCA法测定蛋白质浓度试剂盒、2×Pfu PCR StarMix、质粒DNA小提试剂盒、DNA胶回收试剂盒

1.1.3 主要试剂

酵母抽提物、胰蛋白胨、氯化钠、氯化钾、Na2HPO4、KH2PO4、50×TAE缓冲液、硫酸卡那霉素、IPTG、小牛胸腺DNA、MgCl2·6H2O、Tris-HCl (pH 6.8) 缓冲液、6×Sucrose DNA Loading buffer、琼脂糖

1.1.3 培养基和工作液

LB培养基：酵母抽提物0.50 %；胰蛋白胨1.0 %；NaCl 1.0 %；pH 7.0-7.5（一般固体培养基中加入2.0%的琼脂粉）

卡那霉素溶液：取0.050g 硫酸卡那霉素溶于1.0 mL ddH2O中，配成50mg/mL母液，过滤除菌，分装，-20 ℃保存。

IPTG 溶液：取0.238g IPTG 溶于10 mL ddH2O 中（配成0.10 M 母液），过滤除菌后分装，置于-20 ℃保存。

小牛胸腺DNA底物溶液：取0.041 g MgCl2·6H2O和0.001 g小牛胸腺DNA溶于200 µL pH 6.8，1 M的Tris-HCl缓冲液，最后加ddH2O定容至10 mL。

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