1、材料与方法源'自-751;文,论`文'网]www.751com.cn
1、1材料
1、1、1实验材料
该实验以GP和H602为亲本构建的RIL群体为研究对象,共有126种品系的大麦籽粒(其中含有124个子代大麦籽粒和GP、H602两个亲本的大麦籽粒)。
1、1、2实验试剂及制备方法
1)裂解液的制备:取2.7g尿素和0.2g CHAPS溶于3ml的灭菌的去离子水中,进行搅拌使其完全溶解(终体积用灭菌的去离子水定容至5ml),放置4℃保存备用。使用前加入1M的DTT每65ul/ml。
2)1M的DTT的制备:取1.5425gDTT加入10ml的灭菌的去离子水中,搅拌使其充分溶解,放如棕色试剂瓶中4℃保存备用。
3)工作液的制备:按照BCA Reagent A : BCA Reagent B =100:1的比例混合后来制备成工作液。制备好的工作液可放置4℃保存三天使用。
1、1、3实验仪器及设备
水浴锅,移液枪,酶标仪,离心管,离心机,超声仪,微孔板,天平,药勺。
1、2样品实验方法
1、2、1大麦籽粒样品的前处理
由GP和H602为亲本进行自交而得的子代全体及亲本作为研究对象,成熟后进行采集。采集后进行烘干脱水处理,再剥去外皮表面的壳。再对剥完壳的大麦籽粒进行研磨,获得大麦籽粒粉末,分别编号装袋放置阴凉通风处保存备用。
1、2、2大麦籽粒蛋白质的提取
1)样品制备:称取60mg(±0.03mg)样品粉末加入2ml的离心管中,加入600ul裂解液(加入1M的DTT)后立即充分振荡,振荡5min。每个样品做两个平行。
2)样品超声:将振荡后装有样品的离心管按序插入浮板中加入超声仪中进行超声,超声40min。
3)样品离心:将超声后的样品擦干后按序放入离心机中,进行离心12000rpm,30min。
4)样品提取:将离心后的样品轻轻取出,用移液枪取出上清液放入新的离心管中待用。
1、2、3大麦籽粒蛋白质含量的测定
1)从有样品上清液的离心管中分别取出100ul的待测样品加入微孔板中,每种样品取两个平行进行测定。
2)再在有样品的微孔板中加入100ul的工作液,立即平移晃动混匀(不要晃出),留一空加入蒸馏水代替样品用于调零。
3)将加好样品的加入37℃的水浴锅中恒温反应60min,反应结束后将微孔板取出冷却至室温。
4)将酶标仪的波长设定在562nm处对样品进行测定,用蒸馏水调零,尽量在20分钟内完成所有样品的酶标仪检测,以保证数据的准确度(检测样品时建议同BSA标准品溶液同时进行检测)。
5)检测完成后将个样品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值,再根据标准曲线公式计算出检测样品的蛋白质浓度。