P. aeruginosa是一种能引起动物包括人类疾病的常见微生物,广泛分布于水源、土壤、皮肤和大多数环境中。该微生物能广泛的利用多种有机物,可以感染破损的组织,引起炎症甚至是败血症,如果在人体关键的部位,例如肺、泌尿系统和肾脏造成病变,会引起致命性的结果[23-26]。因此,如果要将由这种条件致病菌分泌的弹性蛋白酶安全地应用在工业化领域上,必须将弹性蛋白酶基因(lasB)在安全宿主中表达。
2.1在大肠杆菌中表达
Robert A. Bever等人将P. aeruginosa PAO1的弹性蛋白酶基因(lasB)构建到了质粒pUC18,并在大肠杆菌中表达。结果表明lasB基因的启动子和翻译起始因子在大肠杆菌中能发挥作用,由大肠杆菌表达的重组弹性蛋白酶与天然酶具有相似的分子量[1]。Hiroyasu Ogino等人将P. aeruginosa PST-01的弹性蛋白酶基因在大肠杆菌中成功地表达,基因表达产物没有分泌到胞外,重组弹性蛋白酶原在细胞溶解后释放,自我水解形成成熟弹性蛋白酶(分子量为33.1kDa)。在有机溶剂中,重组蛋白酶与其天然野生蛋白酶同样具备良好的稳定性[27]。Lin Hsin-Hung等人将lasB基因利用表达载体pET-43b(+)在大肠杆菌 AD494(DE3) pLysS中表达,得到了可溶的重组酶蛋白。重组酶蛋白经过镍柱纯化达到了电泳纯,重组酶的酶学性质与天然酶相似[28]。
2.2在毕赤酵母中表达
毕赤酵母是一种能够成功表达异源蛋白宿主,具有基因操作的便利性、能达到较高的细胞密度、能在廉价培养基上快速生长、具有翻译后修饰的能力等优点。另外,毕赤酵母具有公认的生物安全性,在表达异源蛋白过程中不产生内毒素和病毒[29-31]。因此,选择将lasB基因在毕赤酵母上表达是合适的。Lin Xijin等人将lasB全长基因插入到pPIC3.5K表达载体上,使lasB基因在毕赤酵母KM71上成功表达[32]。载体pPIC3.5K没有编码信号肽碱基序列,在lasB基因表达的信号肽引导下,重组弹性蛋白酶能分泌到毕赤酵母胞外,这说明lasB基因编码的信号肽能有效地被毕赤酵母识别并发挥作用。重组弹性蛋白酶经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,其分子量大概为34kDa;在发酵上清液中,重组酶的浓度达到了450mg·L-1,酶活力是原产酶菌株P. aeruginosa的2.6倍[32]。