1. 实验部分
1.1 材料和仪器
1.1.1 实验材料
大豆品种为“周豆17”,由植物遗传与分子育种重点实验室提供;木霉13-1是由芦荟根部土壤中分离纯化而来,经鉴定为哈茨木霉,于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)平板上28℃培养7d待用;核盘菌分离自田间大豆核盘菌病株并置于PDA培养基上于28℃培养3d待用。
1.1.2 仪器设备
三孔恒温水浴锅(SM-8D):南京舜玛仪器设备有限公司;
移液枪:Eppendorf,中国有限公司;
超净工作台:苏州宏瑞净化科技有限公司;
冰箱:BCD-226SDM,青岛海尔股份有限公司;
pH 计:PHS-3C,上海精密科学仪器有限公司:
恒温培养箱:Eptisa中国有限公司;
高速离心机:5804R/5417R,Eppendorf中国有限公司;
电子天平:PL-230,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;
紫外分光光度计:Spectrumlab 752 Pro;
台式恒温振荡器:上海精宏实验设备有限公司;
立式压力蒸汽灭菌器:LS-35HJ-型,江阴滨江医疗设备有限公司。
1.1.3 试剂
无水乙醇、CaCO3、石英砂、1000µg/mL标准牛血清蛋白、草酸钠、乙酸乙酯、连二亚硫酸钠(俗称保险粉)、67mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、0.5mol/L pH5.5磷酸缓冲液、0.1mol/L儿茶酚、20%三氯乙酸(TCA)、0.05mol/L愈创木酚溶液、2%H2O2、0.5%硫代巴比妥酸。
80%丙醇:80mL丙醇溶液+20mL蒸馏水,混匀。
100mg/L考马斯亮蓝G-250试剂:100mg试剂溶于50ml90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100mL,最后用蒸馏水定容至1000mL。
饱和醋酸铅:称取适量醋酸铅粉末溶于稀硫酸溶液中,加入粉末直至溶液中有晶体析出,即为饱和醋酸铅溶液。
1g/L蒽酮试剂:称取1g经过纯化的蒽酮,用稀硫酸溶液(由760mL比重为1.84的浓硫酸加到300mL水中)溶解并定容至1000mL。测定时新鲜配置。
200mg/L葡萄糖标准溶液:称取100mg已在80℃烘箱烘至恒重的葡萄糖,用蒸馏水溶解,即得200mg/L的葡萄糖标准溶液。此液放入冰箱中保存,使用前1h取出回升至室温。
1mol/L H2SO4:用量筒量取比重1.84的浓硫酸55mL,边搅拌便加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000mL。
0.4mol/L琥珀酸钠:称取琥珀酸钠(含6个结晶水)10.81g,溶于蒸馏水中,定容至100mL。
1.2 方法
1.2.1 木霉13-1菌及核盘菌和的活化
在无菌操作台上用高温灭菌过的接种针挑取适量木霉13-1菌及核盘菌菌丝接种到PDA固体平板上,于25℃的培养箱中培养2d,之后第二次活化进行生孢培养,将孢子接种于PDA液体培养基溶液上,于摇床上28℃,200r/min培养3d待用。
1.2.2 周豆17的播种
在对菌株进行活化的同时,对培养土进行灭菌,之后分装到盆中,大豆用蒸馏水浸泡3个小时后播种到盆中,每盆3颗大豆种子,共48盆。
1.2.3木霉菌株代谢产物溶液的制备
取108个木霉孢子接种于PDA培养基,28℃,200r/min培养7d后,将孢子液用16层纱布过滤,获得木霉代谢产物溶液。
1.2.4 大豆幼苗的浇灌处理
木霉代谢产物均匀浇灌大豆幼苗根部,每株浇灌200mL,每个处理24个重复,并用培养基浇灌做对照,每隔5d浇灌一次,处理7次,40d后测量各种指标。
1.2.5 大豆叶片接种核盘菌
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片,放入培养皿中接种核盘菌,一周后统计发病率。
1.2.6 大豆叶片胁迫处理
随机剪取处理组和对照组大豆植株叶片,放入含有CaCl2和NaCl溶液中的培养皿中,浓度依次为0mmol/L和150mmol/L,胁迫时间为1d,采用NBT(氮蓝四唑)、埃文斯蓝(Evans blue)染色和DAB(二氨基联苯胺)染色,同时,进行MDA含量的测定,采用研磨法提取。
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