水生物种卵细胞显微注射技术及实验研究(5)

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1.2.2 细胞注射系统各功能技术难点

（1）细胞寻找与固定技术

目前细胞注射使用最多的寻找和固定细胞的方法为视觉引导末端执行器在培养皿中搜寻细胞。即由图像采集模块检测吸持针与细胞之间的相互位置关系信息，将此信息反馈给末端执行器的伺服电机，伺服电机驱动末端执行器带动吸持针在培养皿中逐个寻找、固定待注射细胞，固定后将细胞移至视野中央进行注射，这种方法不仅对图像处理单元的实时性和处理速度提出很高的要求，同时也需要其具有从培养皿中众多细胞里分辨出未注射细胞的功能。

细胞在培养皿中的位置不固定，且吸持针的移动也会造成培养液的扰动，进而连带细胞位置变化，这将增加图像实时监测、细胞寻找、固定的难度，且这种方式的系统成本高、稳定性差、细胞注射效率不高。

（2）注射针快速刺膜技术

细胞膜由磷脂双分子层和蛋白质及外表面的糖被（糖蛋白）组成，蛋白质镶嵌在磷脂双分子层中，因此在注射针刺膜的过程中，细胞膜很容易因为轴向的粘弹性而径向破碎[2]。细胞是一个有机的整体，但细胞骨架和膜系统的强度却相对薄弱，刺膜过程中若速度很慢或产生严重的横向摆动，细胞骨架和膜系统便会大面积破碎，细胞内部结构遭受破坏，影响细胞的完整性和内部物质、信息的传递传导，从而破坏细胞活性。根据外源物质的不同，注射针在细胞内注射的位置亦有所差异，因此需要对注射针精确定位，但注射针针尖刺入细胞后其位置便难以检测，其位置决定于注射针的定位精度，因此细胞注射的刺膜质量和定位质量直接决定了细胞注射成功与否。

当前的电机驱动机械手以及机械旋钮式微机械手均无法满足细胞对刺膜速度及定位精度的要求，利用压电伸缩式微操作手虽可解决这一问题，但其不具备足够的有效行程，且存在迟滞效应和线性失真。因此，急需研究一种能满足上述所有要求的工作台用于控制注射针的运动。

（3）精准定量注射技术

用于细胞注射的微注射针是内径非常小的细长结构，微尺度效应明显，进行注射时，注射针内的试剂所受的流动阻力很大，时均流量小，属低雷诺数流动，流动稳定性差，时常出现不正常流动[3]。目前使用的注射量控制装置通常由注射针、压力控制系统以及软管组成，多利用气/液压差驱动，但由于气体和液体本身的物理性质，气/液压差驱动有很大的驱动阻力，且系统中的弹性密封处容易发生形变和漏气/液，从而影响注射量的精度。而且这种方式存在的驱动死区还会影响注射量控制的灵敏度。

1.3 水生物种卵细胞注射

1.3.1 水生物种卵细胞注射特点

对于研究分子生物学而言，体外受精、卵细胞数量多的水生物种是理想的动物模型，不同于哺乳动物体内繁殖卵细胞的是，水生物种卵细胞为体外繁殖，因而卵细胞需要携带大量的营养物质共胚胎发育，所以表现为卵细胞体积大。以本文中实验使用的日本沼虾卵为例，其直径可达600μm左右。

水生物种卵细胞具有数量多、季节性强的特点，导致水生物种卵细胞注射的工作量时间集中，强度大[4]。在大批量长时间的条件下进行手动细胞注射对操作者的技术是极大的挑战，手动注射的质量稳定性难以控制、注射效率低、细胞的存活率也受到影响，因此手动注射的方法难以满足大批量长时间的注射要求。

1.3.2 水生物种卵细胞注射研究意义

随着人们对健康的重视，水生物种类日渐取代普通家禽类成为人类更加偏好的蛋白质来源，通过细胞注射对水生物种的性状进行改造，将对水生物种的性状有利的基因，如干扰素、抗病抗寒性基因导入水生物种卵[5]，对提高商品产量和抗逆性有着十分重要的现实意义。具体应用意义如下：（1）改良产品品质，例如肉色、形态、口感、营养素构成比例等；（2）提高经济效益，包括重量、生长速度、饵料转化率及净肉率等指标；（3）作为研究繁殖、生长、发育的实验模型；（4）用作生产药品的生物反应器。