1.2 T7 RNA 聚合酶简介
T7RNA聚合酶(英语:T7 RNA Polymerase)是一种RNA聚合酶,分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性,且只会转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。在体内T7 RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列,转录效率很高[10]。
此酵素在合成RNA的过程中,需要DNA模板与镁离子(Mg2+)作为辅因子。牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)及精胺(spermidine)对此酵素具促进效果。与细菌的RNA聚合酶的差异之一,在于T7 RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素(rifampicin)抑制。
1.2.1 T7 RNA聚合酶的结构
T7 RNA聚合酶最初是被从T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的[20]。T7噬菌体是一种中等大小的噬菌体,其线状双螺旋DNA由39 936bp组成。T7噬菌体编码的唯一RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶,其编码基因长度为2 652bp[21]。
T7 RNA聚合酶从结构上看与一个包含有单亚基DNA聚合酶和RNA聚合酶的核苷酸聚合酶家族有关。X光研究已经表明, T7 RNA聚合酶的和许多DNA聚合酶的三文结构之间存在着一个明显的相似性(图1)[22,23,24]。因此,T7 RNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I的克莱诺片段在结构上表现出了非常高的相似性:当这些酶发生聚合作用的区域叠加时,这两个结构上所有的α-螺旋和β-链(除了一个)都是彼此互补的。在这些区域的形状类似于一个人右臂(并且包含“手掌”,“拇指”和“手指”)[24],而由亚结构域所形成的深沟状结构是对DNA模板的结合位点。
1.2.2 T7 RNA聚合酶与启动子的相互作用
RNA聚合酶识别的启动子由高度保守的23个碱基序列组成。保守序列跨越转录起点(﹢1)并从﹣17延伸至﹢6[26]。T7启动子明显由两个功能点组成:结合(﹣17到﹣6)和启动(﹣6 到﹢6)。前者的突变导致在启动速度无明显影响的情况下T7 RNA聚合酶的亲和力减少了,而后者的突变虽然对酶的影响很弱,但对RNA的合成有极大的影响[23]。
在体内T7 RNA聚合酶几乎能完整地转录在T7启动子下游的所有DNA序列,转录效率很高[27]。
2 实验原理
2.1 构建带有T7启动子及his标签基因的质粒
pET-29a-c(+)载体携带一个N末端S•Tag™凝血酶构型,此外还有一个可供选择的C末端组氨酸标签序列。这些独特的位点显示在下面的图中。本图通过pBR322定律来进行数字标记,因此T7表达区域在图中发生了颠倒。通过T7核糖核酸聚合酶编码链转录的克隆表达区域显示在下面。调整f1起始端以便影响辅助噬菌体产生包含单链DNA病毒,这相当于编码链。因此,单链序列要使用T7终止子引物来操作。
图2 pET-29a(+)
图3 pET-29a(+)基因序列图
2.2 细胞破碎
微生物代谢产物大多数分泌到细胞外,如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等,称为胞外产物。但是有些目的物存在于细胞内部,如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等,称为胞内产物。分离提取胞内产物时,首先必须将细胞破碎,使产物得以释放,才能进一步提取[27]。近年来常用的细胞破碎方法有以下几种:(a)高压匀浆法;(b)高速珠磨法;(c)超声破碎;(d)酶溶法;(e)化学渗透法;(f)液氮研磨破碎法[28]。根据本实验要求选用液氮研磨破碎法。
液氮即液态氮气,为无色透明、无、无毒的低粘度的透明液体,不导热不导电,不自燃助燃,化学性质稳定,不与任何物质起化合作用。1单位体积的液氮可产生约650倍体积的氮气[29]。液氮的温度为-196℃,它既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。
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