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根据生物药物的性质和特点常用的定量分析方法包括酶法、电泳法、免疫分析法、理化测定法、生物检定法。本课题采用理化测定法中的HPLC法对555定量分析方法进行验证。HPLC是在经典气相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法，近几年随着计算机技术的发展，逐步实现了HPLC和各种检测仪器的联用，使其应用范围得到了极大的拓展[10]。并且由于其具有分离效率高、灵敏度好、选择性强、含量测定准确等优点，现已广泛的应用在药品检验工作中，更为本课题的研究提供了准确的数据来源。
2 材料和方法
2.1 仪器和试剂
表2-1 实验仪器
仪器 制造商
高效液相色谱仪LC-20A 日本岛津公司
电子分析天平XS105 梅特勒-托利多集团
电子分析天平AL204 梅特勒-托利多集团
低温光照仪LS-3000uv 上海君翼仪器公司
移液枪 德国艾本德公司
超声波清洗机 浙江法兰特超声波科技有限公司
表2-2 实验试剂
试剂 制造商
555样品 江苏万邦生化医药股份有限公司（自制）
555对照品 中国药品生物制品检定所
乙 腈（色谱纯） 美国默克公司
磷 酸（分析纯） 中国医药集团
氯 化 钠（分析纯） 中国医药集团
氢氧化钠（分析纯） 中国医药集团
30%过氧化氢（分析纯） 中国医药集团
二水合磷酸二氢钠（分析纯） 中国医药集团
2.2 溶液配制
0.01mol/L盐酸（1L）：精密吸取12mol/L的盐酸溶液0.83ml溶于999.17ml的双蒸水中，摇匀即得。
9.6mol/L盐酸（10ml）：精密吸取12mol/L的盐酸8ml溶于2ml的双蒸水中，摇匀即得。
1mol/L盐酸（10ml）：精密吸取12mol/L的盐酸0.83ml溶于9.17ml的双蒸水中，摇匀即得。来!自~751论-文|网www.751com.cn
10mol/L氢氧化钠（10ml）：精密称取氢氧化钠固体4g溶于10ml的双蒸水中，摇匀即得。
1mol/L氢氧化钠（10ml）：精密吸取10mol/L的氢氧化钠溶液1ml溶于9ml双蒸水中，摇匀即得。
磷酸盐缓冲液（1L）：精密称取磷酸二氢钠20.7g，加水800ml溶解，再用85%磷酸调节pH至2.5，加水至1000ml，滤过即得。
流动相A（1L）：精密称取氯化钠18.4g，加磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈250ml，混匀后，用水稀释至1000ml，滤过作为流动相A。
流动相B（1L）：精密称取氯化钠3.2g，加磷酸盐缓冲液250ml溶解，加乙腈650ml，混匀后，用水稀释至1000ml，滤过作为流动相B。
2.3 定量分析方法的建立
本课题采用高效液相色谱法，所使用的色谱柱型号为Inertsil ODS-SP，250mm×4.6mm，5μm，GL Science Inc，色谱柱柱温设定至35℃。检测波长设定为214nm，检测流速为1.0ml/min。进样器温度为5℃，每次进样20μl，洗针液采用50%甲醇水溶液，运行时间为40min，流动相比例见表2-3。