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摘要：DNA 片段经过连接产物、转化感受态大肠杆菌培养，获得的重组菌落不一定是预期 所需要的，其中很可能有：各种突变、载体自连以及多拷贝插入的基因反向连接等不需要 的重组菌，因此需要进行筛选和鉴定。本实验通过菌落 PCR 技术，直接以单菌落为模板进 行 PCR 扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增出的目的条带与 Marker 大小比对， 简便、快速、可靠地筛选出含有目的片段的阳性克隆。 70298
关键词：筛选，菌落 PCR，阳性克隆
Abstract：DNA fragments after ligation products and transformed into competent E.coli culture, the recombinant colonies is not necessarily the needed expectations, which is likely to have: a variety of mutations, vector self ligation and multi copy gene insertion of reverse connection does not require recombinant bacteria. Therefore, it is necessary were screened and identified. This experiment through the colony PCR technology directly to single colony as template was
amplified by PCR and then by agarose gel electrophoresis, according to amplified the purpose to compare with the marker size. This method is simple, rapid, reliable screened with containing fragments of the positive clones.
Key words：screening, colony PCR, Positive clone
目录
1 综述 4
2 实验试剂和器材 5
2.1 实验材料 5
2.2 实验仪器 5
3 方法 5
3.1 单菌落挑取 5
3.2 菌落 PCR 反应 6
3.2.1 PCR 原理及特点 6
3.2.2 配制 PCR 反应体系 6
3.2.3 PCR 反应 7
4 结果与分析 7
4.1 菌落 PCR 电泳图分析 7
4.2 菌落筛选中常见的问题 9
4.3 PCR 反应中各组分对反应影响讨论 9
4.3.1 DNA 模板 9
4.3.2 聚合酶及其浓度 10
4.3.3 镁离子浓度 10
4.3.4 dNTP(四种脱氧核苷三磷酸)的质量与浓度 10
总结 11
参考文献 12
致谢 13
1 综述
基因工程又称为重组 DNA 技术，主要是指基因的克隆、重组和表达，是将一种生物 体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一生物体（受体）内，使其按 照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的 DNA 体外操作程序，也称为分子克隆 技术。DNA 重组技术的主要过程包括以下五个方面：
① 从供体细胞中分离出 DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源 DNA（包括外源基因和目 的基因）和载体切开；
② 用 DNA 连接酶将含有外源 DNA 的基因片段连接到载体上，形成重组质粒；
③ 借助细胞转化的手段将重组质粒导入受体细胞中； 论文网
④ 将转化后的细胞进行扩大培养，以便扩增重组 DNA 分子，使其整合到受体细胞的基因 中去；