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隔水式恒温培养箱 GHP-9160 上海一恒有限公司
3 方法
3.1 单菌落挑取
（1） 准备工作
1.从 37°C 培养箱中取出前一天晚上连接转化好的平板，观察菌落的生长情况，看平板是
否大面积光板，有无实心斑、噬菌斑，并根据连接片段的大小、GC 含量、Tm 值和菌落的 抗性进行排板。
2.取出已经灭菌的 LB 培养基，加入抗性，混匀后把 LB 培养基倒入已用酒精灯灭菌的排 枪槽中，然后用排枪加 400μl 菌液到 48 孔板中。
（2）挑取单菌落
用镊子拿已灭菌的小枪头挑取平板上的单菌落放在 96 孔 PCR 反应板中，同时在 96 孔筛选 表的相应位置上做好记录。枪头粘于管壁的菌落可以作为 PCR 反应的模板，普通的片段和 全长挑 8 个克隆，对于特殊要求或难度订单要多挑，可以增加克隆。挑好的 48 孔板用封 口膜盖好并做好相应标记，用针头在封口膜上打孔，然后放在 200r/min 摇床上 37°C 培养 4-6 小时
3.2 菌落 PCR 反应 来`自^751论*文-网www.751com.cn
3.2.1 PCR 原理及特点
聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增 DNA 的方法，该技术最大的特点是 操作简单、特异性强、灵敏度高[6]。该原理与细胞中 DNA 的复制过程极其相似。当双链 DNA 分子在加热过程中达到一定温度的时候，双链 DNA 就会分离成两条单链的 DNA 分 子，接下来单链 DNA 分子作为 DNA 聚合酶的模板，利用反应混合物中的四种脱氧核苷三 磷酸（dNTPs）合成新的 DNA 互补链[7]。不断重复这一过程，即可使目的 DNA 片段得到 扩增。这是 PCR 技术的第二个特点，能够让特定的 DNA 片段准确、高效的大量扩增。
正是因为两条单链 DNA 可以作为合成新生互补链的模板，所以满足了为每条链都能 提供一段寡核苷酸引物的需求。
3.2.2 配制 PCR 反应体系
反应体系 体积
无菌 ddH2O 23μl
10*PCR 缓冲液 3μl
正向引物（25pmol/μl) 0.5μl
反向引物（25pmol/μl) 0.5μl
dNTP（10mmol/L) 0.3μl
菌液 2.5μl
Taq DNA 酶(5U/μl) 0.2μl
总体系 30μl
3.2.3 PCR 反应
（1）菌落 PCR 扩增
1.把配制好的工作液混匀，加到 96 孔反应板上，每管 27.5μl。加好后在 96 孔反应板的边
缘上标记上 48 孔板中对应的菌液名称。
2.取出培养好的菌液，从 48 孔板中每孔吸取 2.5μl 分别加进对应的 96 孔反应板中。
3.把 96 孔反应板放在 PCR 仪器上盖好橡胶垫，按照下面的 PCR 反应条件进行反应。
PCR 扩增的反应条件：