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⑤ 对转化后的细胞进行筛选和鉴定，以便获得外源 DNA 高效稳定表达的基因工程菌或细 胞[1]。
DNA 片段经过连接转化培养后，需筛选平板上的重组质粒菌落，挑出含有插入目的基 因片段的重组阳性克隆。如何快速简便的挑出重组阳性菌落是关键的一步。通常重组子筛 选的方法有：蓝白斑筛选；提取并纯化质粒，依靠酶切或测序等手段检测插入 DNA 是否 正确；PCR 筛选；菌落杂交[2]。这些方法各有优缺点，比如蓝白斑筛选需要载体有特殊的 结构，对于插入的目的基因是小分子 DNA 片段的重组子时，蓝白斑不易鉴别；提取质粒 酶切法当筛选的样品较多时，操作比较繁琐，耗时较长。
通过菌落 PCR 技术，其特异性依赖与靶细胞两端互补的寡核苷酸引物。PCR 反应由 变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成：①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经过加热至 95°C 左右一定的时间后，使模板 DNA 双链或经过 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为 单链 DNA，以便与引物结合；②模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经过加热变 形成为单链后，温度降至 55°C 左右，引物与模板 DNA 的单链互补配对；③引物的延伸： DNA 模板与引物结合体在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料、靶序列为模 板，按照碱基互补配对原则，合成一条新的与模板 DNA 互补的半保留复制链，重复循环 变性-退火-延伸三个过程。获得更多的半保留复制链，并为下次循环提供模板，经过 2-3 小时反应就能将待扩的基因扩增到几百万倍。然后通过琼脂糖凝胶电泳与 Marker 大小比对， 筛选出含有目的基因的阳性克隆。
2 实验试剂和器材
2.1 实验材料
灭菌 ddH2O、Taq buffer、dNTP、Taq DNA 聚合酶、DMSO(二甲基亚砜)、TE、正反向引 物、LB 培养基、抗生素、琼脂糖、溴酚蓝、48 孔板、96 孔 PCR 反应板、封口膜、酒精灯、 灭菌 EP 管、灭菌枪头、排枪、镊子、96 孔筛选表、检测胶
2.2 实验仪器
表 2-1 实验仪器
实验仪器名称 规格型号 生产厂家
梯度 PCR 仪 PTC-225 MJ.Research
PCR 仪 Thermal Cycler 2720 Applied Biosystems
电泳仪 DYY-8C 型 北京市六一仪器厂
生物电泳图像分析系统 仪器
Biosens SC 720B 文献综述
山富科学仪器有限公司
台式离心机 5415D 德国公司
电热恒温水槽 DK-8D 型 上海精宏实验设备有限公司
微量移液器枪 P10，P20，P100，P200， P1000
德国公司
冰箱 BCD-239VC 新飞
微波炉 P7021TP 格兰仕集团
恒温振荡器 WH-861 型 江苏太仓市华美生化仪器
全温振荡培养箱 HZQ-F280