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结 论 16
参考文献 17
致谢 19
1 前言
1.1 研究背景
地球上分布最广、蕴藏量最丰富的可再生资源之一是纤维素，每年由光合作用产生的植物干质量约220亿吨，其中纤维素占50%1。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系2包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，该三种酶通过协同作用将纤维素转化成葡萄糖3。早在1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶,并随着在饲料、制糖、化纤、造纸工业4，以及处理废物，消除公害，保护环境等方面的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。所以研究纤维素酶的分离纯化以及纤维素酶组分的酶学性质，是实际生产的要求又是现代科学研究的需要，同时质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在，而外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶，在木质纤维素降解成还原糖的过程中，外切葡聚糖酶起着非常关键的作用[5]。论文网
马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一类非传统的酵母。近年来，由于其具有耐高温、可利用底物广泛、蛋白分泌能力强、生长速率快等优势以及在纤维素乙醇生产中的良好应用前景而受到人们的关注[6, 7]。马克斯克鲁维酵母可以在30 ℃- 45 ℃温度下利用多种纤维素原料进行乙醇发酵，包括各种农产品副产物与废弃物，如稻杆、麦杆、水果榨汁后的残渣等，以及一些能源草类植物，如柳枝稷、狼尾草等[7]。
1.2 立题依据
随着纤维素酶研究与应用的进一步深入,必将使用纤维素酶来解决全球的环境污染、粮食短缺、饲料资源紧张和能源危机等问题。虽然很多种微生物及多种动物已被发现能产生纤维素酶,但能产真正高效产酶的菌种还不多,并且性能稳定性不够,纤维素酶生产规模还有待于进一步扩大。同时由于纤维素酶发酵活力低,因此其相应应用成本较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶,比活力至少要低到1~2个数量级,如滤纸酶的比活力为1 IU/mg左右,CMC的比活力约为10 IU/mg8,从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题,也是纤维素酶研究的热点与难点。纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量待解决问题的酶,也是具有巨大工业和市场潜力的酶。
本文研究的内容和目的：对重组马克斯克鲁维酵母产外切葡聚糖酶进行纯化，并对其酶学性质进行初步分析。
2 材料与方法文献综述
2.1 菌株
成功表达重组外切葡聚糖酶的马克斯克鲁维酵母菌株(CHBⅡ),本实验室保存。
2.2 培养基与试剂
2.2.1 培养基
YPD 液体培养基9：葡萄糖2.0%（w/v），酵母粉1.0%（w/v），蒸馏水定容至50 mL,121 ℃高温灭菌20 min。
发酵培养基10：0.2% YNB，1% 葡萄糖，5 mmol/L乙酰胺（分子量59g/moL）,用0.1 M磷酸缓冲液（pH6.0）配制，121℃高温灭菌20 min。250 mL锥形瓶装液量50 mL（乙酰胺需过滤灭菌）。将0.2% YNB倒入1% 葡萄糖，加入1 mL乙酰胺，混匀。
2.2.2 试剂
0.1 M磷酸缓冲液（pH6.0）：1L蒸馏水中加入13.682 g二水磷酸二氢钠和4.405 g十二水磷酸氢二钠；
0.2%YNB：0.1 gYNB粉末和24 mL磷酸缓冲液（pH6.0）；
1%葡萄糖：0.5 g葡萄糖和25 mL磷酸缓冲液（pH6.0）；