- 上一篇：怀菊花活性成分及抑菌作用研究
- 下一篇：大肠杆菌细胞表面展示条件的初步优化和实验分析
考马斯亮蓝染液/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
蛋白质浓度（μg/mL） 0 10 20 30 40 60 80
图1 可溶性蛋白质标准曲线
1.3.3 样液的测定
样品液：取大豆粉1 g，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。
另取三支干净试管，分别加入样品液1 mL及考马斯亮蓝染液4 mL，混匀，室温静置3 min，于波长595 nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线求出蛋白含量。
注意：样品蛋白质含量应在10~100 μg 为宜。
1.4 样品液中可溶性糖含量测定
实验采用蒽酮比色法，其测定原理：糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，它们可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在620 nm处有最大吸收。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，可用于糖的定量测定。
1.4.1 试剂配制
蒽酮试剂：取2 g蒽酮溶于1000 mL 80%(V/V)的硫酸中，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液( 0.1 mg/mL) ：100 mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000 mL。
1.4.2 可溶性糖标准曲线的制备
取干净试管6支，按下表进行操作
表2 蒽酮比色法定糖-标准曲线的制作
0 1 2 3 4 5
标准葡萄糖溶液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
蒸馏水/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
置冰水浴中5min
蒽酮试剂/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
沸水浴中准确煮沸10 min，取出，用自来水冷却，室温放置10 min，在620 nm处比色
以第一管为空白，于波长620 nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）作为横坐标作图得标准曲线。
图2 可溶性糖标准曲线
1.4.3 可溶性糖的提取和测定
称取大豆粉0.5 g于锥形瓶中，加15 mL蒸馏水，用塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，冷却后过滤并定容至100 mL，此为待测液。吸取待测液0.5 mL于试管中，加蒸馏水0.5 mL，浸于冰水浴中冷却，再加入4 mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10 min，取出用自来水冷却后比色，由于黄豆之间也存在差异可能导致可溶性糖变化结果不同[9]，所以该实验都做了三个平行实验。其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
W（总糖）=C*V/m * 100%
式中w（总糖）：总糖的质量分数（%）；C：从标准曲线上查出的糖含量（mg/ mL）；V：样品稀释后的体积（mL）；m：样品的质量（mg）。
1.5 样品液中铁含量测定[10-12]
采用邻菲啰啉比色法测定。原理：在一定酸度条件下，试液中亚铁离子（Fe2+）与1,10-邻菲啰啉生成红色配合物，于波长为506 nm处，测定其吸光度，即可计算出铁含量。
1.5.1 试剂配制
2.5 g/L 1,1 0-邻菲啰啉溶液：称量2.5 g 1, 10-邻菲啰啉溶于80 ℃的约l00 mL蒸馏水中，加1 mL浓盐酸，冷却后加水稀释至1000 mL，储于阴凉处备用。
醋酸-醋酸钠缓冲溶：称量272 g醋酸钠于约500 mL蒸馏水中，加入冰醋酸240 mL，加水稀释至1000 mL，备用。
Fe2+标准溶液，20 μg/mL：吸取1 mg/mL的亚铁标准溶液（称量7.024g硫酸亚铁铵于约500 mL蒸馏水中，加入浓盐酸10 mL，移入l000 mL容量瓶中，稀释至刻度）20 mL于1000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，临用前配制。