转基因番茄国内外研究现状综述(2)

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目前MCM2-7蛋白质基因已在多个高等植物中被确定，其中已经确定的高等植物有拟南芥、玉米、水稻、烟草和豌豆等，最近的一次实验研究了MCM2-7在DNA复制和其他方面的发展作用（Tuteja et al. 2011）。并且MCM2-7的同源物已在拟南芥被找出（Dresselhaus et al. 2006; Masuda et al. 2004; Shultz et al. 2007; Tuteja et al. 2011）;但是，对于MCM的每个子单元的详细分析还比较少。拟南芥MCM7基因一直是许多研究的主题，被选为代表的植物MCM功能的主要单元之一。MCM7是必不可少的拟南芥突变体种子显示胚和胚乳的形成缺陷以及显示生育缺陷（Holding and Springer 2002; Springer et al. 1995, 2000）。有研究表明MCM7的突变体也显示出母体效应，其中种子继承突变母体等位基因（和一个野生型等位基因父系）也具有的表型。这种表型被认为是由于在胚珠需要官能MCM蛋白。除了MCM7以外，MCM2被证实也是在拟南芥中必不可少的一个基因，虽然相比MCM7基因之下，MCM2暂时还未在突变体中观察到母体效应（Ni et al. 2009）。这些有趣的实验结果表明，所有的MCM亚基可能会在拟南芥中发挥各种不同的作用。

这种表型与MCM2基因的关联,由在转录基因植物MCM2的相对转录水平表达在Rb MCM2因启动子定量PCR来确定。研究表明转基因植物在MCM2的相对转录水平略高于或接近相同的野生型植物。结果表明在MCM2表达的该减少是负责减少通过GTP结合蛋白的α亚基的功能丧失引起的胚轴的细胞分裂。由于MCM2基因是胚胎发育至关重要，我们产生的转基因番茄通过RNA干扰抑制MCM2的表达，从而进一步分析LN MCM2功能。转基因番茄苗可以生长出相对于野生型植物较短的下胚轴和较低细胞数目。这一发现可能会出现不足为奇，MCM蛋白是DNA复制机器的组成部分，并非真正的细胞周期调节。此外，它们被认为是作为杂六聚体，提高其他MCM亚基与GTP结合蛋白依赖性细胞周期调控的贡献的问题。以前曾有报道，由35S启动子控制，在MCM2的过表达足以诱导过度增殖根的干细胞，指示MCM2的积累可以是限速为细胞分裂，至少在一些组织中。可替代地，MCM2可能具有MCM-六聚体的外面的功能。事实上，在豌豆，MCM6参与盐胁迫耐受性，这表明植物MCM蛋白可能具有独立的DNA复制或其他的MCM的其他角色。值得一提的是，其他核心细胞周期调节剂，例如ORC1或KRP5，也被分配了新的功能：两种蛋白质能调节基因表达。类似的机构可在GPA1/ MCM2信号通路的情况下运行。进一步的工作应该帮助破译MCM2积累如何控制在胚轴细胞增殖。

RNA干扰技术的研究

RNA干扰技术从20世纪90年代中期开始被发现，接着被广泛应用于基因功能的分析验证，成为一种基因工程策略，在农业中遗传改良的方面也被大量应用于农作物的种质的改良和农作物的抗病毒以及抗寄生线虫等的研究中。构建RNA干扰表达的研究方法在随着生物学技术的发达而不断的发展进化，而构建这种机制首先要构造可以转录为双链RNA可表达的载体，接着得到基因沉默后的转基因株系，从而能够让研究人员进行目的基因的分析，利用这种方法的好处是能够获取在遗传育种方面完全稳定的突变体。研究者一般从方法是否简便、快捷、成功率高来评价植物RNA干扰载体构建方法的优劣。[30]而现今世界上最常被利用的构造RNA干扰表达技术方法有三种，“零背景筛选”技术，用传统的PCR技术进行基因连接，利用限制性内切酶的法则也是一种技术上的突破，而且此法的可行性极高；Gateway技术比较适用于高通量的试验中，该法利用的原理是同源重组，在构造RNA干扰表达中节约了人力物力；人工mi RNA技术，在调节植物的发育、植物的抗逆以及调节激素方面的研究有很大的贡献，此法可以提高干扰实验的成功率并且允许一定的碱基错配或者是在同一时间表达多个人工miRNA分子，同时又操作方便。