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①同时把1.5 g的碳酸氢钠，0.33 g的谷氨酸和一包DMEM粉末溶于适量三蒸水中，并摇匀，再用容量瓶定容到1L；
②再将培养基的pH用稀盐酸调节到7.2；
③放在4℃ 的条件下，静置过夜；
④用二蒸水和三蒸水先后把滤器清洗烘干；
⑥再放在121℃ 温度下灭菌30分钟，以备用；
⑤用滤器过滤培养基，分别装到无菌100 mL的玻璃瓶当中，每瓶装90mL,保存在4℃温度下，以备用。
1.3.2细胞培养
①将SD大鼠（新生24小时内）浸泡在配置好的 75% 无水乙醇中，浸泡 5-10 分钟；
②用眼科剪剪下头部，用镊子和剪头小心分离新生鼠的头盖骨；
③用PBS缓冲液冲洗、小心去除新生鼠头盖骨上的软组织；
④去除后再用PBS缓冲液冲洗干净；
⑤将新生鼠头盖骨放置在血清中，并剪碎为 1 mm × 1 mm 的小块；
⑥再将小块转移至培养瓶中，加入 5ml DMEM 高糖培养基；
⑦将骨片均匀的分散，使骨片的一面向上，置于体积分数5% CO2、37℃的CO2培养箱中倒置培养；
⑧过夜后将培养瓶翻面使骨片浸润在培养液中，之后每 2-3天换液；
⑨细胞传至第三代时，取出用于本次实验。文献综述
1.3.3成骨细胞ALP染色的鉴定
取第3代生长状态良好细胞做染色鉴定，因为碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞前期分化的特殊标志[12]。所以通过碱性磷酸酶染色来鉴定成骨细胞的纯度。
步骤如下所示：
①将第3代细胞固定后，用适量的洗涤液洗涤3-5分钟，再重复洗3-5次；
②按下面参数比例，配制BCIP/NBT染色工作液：
碱性磷酸酯酶显色缓冲液 3ml 10ml
BCIP溶液(300X) 10μl 33μl
NBT溶液(150X) 20μl 66μl
BCIP/NBT染色工作液 3.03ml 10.1ml
③ 洗涤完之后，吸弃洗涤液，加入BCIP/NBT染色工作液，使细胞充分的覆盖；
④ 在室温避光的条件下，培养一段时间，直到显色为预期深浅的颜色；
⑤ 吸弃BCIP/NBT染色工作液，再用蒸馏水重复洗涤2次，终止显色反应；
⑥ 最后，利用相差显微镜观察。
1.3.4实验分组
将第3代细胞接种后分成两组：实验组和对照组，实验组给予含辛伐他汀（1×10-7 mol/L）的完全培养液，对照组给予含等量溶剂无水乙醇的完全培养液进行干预，并在相同的条件下进行培养。
a.培养1天后取出分别进行细胞的形态观察；来!自~751论-文|网www.751com.cn
b.分别培养4和7天时对其碱性磷酸酶活性的定量测定。
1.3.5 细胞形态观察（染色）
①将细胞（密度2×104 cells/cm2 ）接种于24孔板中，培养2天后，用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次；
②用2%戊二醛在4℃ 条件下固定20分钟后，然后用PBS缓冲液清洗2分钟,再重复清洗2次；
③用0.2%Triton X-100在4℃ 条件下透膜处理2分钟，再用PBS缓冲液重复冲洗3次；
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