Rho激酶抑制剂Y-27632在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的(2)

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1材料与方法 2

1.1主要材料 2

1.1.1 实验动物 2

1.1.2 主要试剂 2

1.1.3 主要仪器 2

1.2主要方法 2

1.2.1 大鼠rBMSCs的分离纯化、原代培养及传代 2

1.2.2 CCK-8细胞活力与增殖的检测 2

1.2.3 细胞内总蛋白含量的检测 3

1.2.4 ALP活性的检测 3

1.2.5 RT-PCR法检测蛋白基因的表达 3

2结果与分析 5

2.1 观察原代与传代培养细胞的生长与形态特征 5

2.2 CCK-8检测rBMSCs细胞的增殖情况 5

2.3 rBMSCs细胞ALP活性的检测情况 6

2.4 RT-PCR结果分析 7

2.4.1 上游转录因子Runx-2mRNA在四组实验中的表达情况 7

2.4.2 其它下游成骨蛋白OCN、OST mRNA促成骨分化的表达情况 7

3讨论 9

参考文献 10

致谢 11

图清单

图序号图名称页码

图1 倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长特征（x100） 5

图2 骨髓间充质干细胞的生长情况 6

图3 不同药物组份对rBMSCs ALP活性的影响 6

图4-1 四组实验Runx-2 mRNA相对表达量 7

图4-2 四组实验OCN mRNA相对表达量 8

图4-3 四组实验OST mRNA相对表达量 8

表清单

表序号表名称页码

表1 标准样品加样量 3

引言

随着中国人口日益老龄化，骨质疏松症患病率逐年升高。目前，中国则有近4千万人因骨质疏松而发生骨折，造成了严重的社会及经济负担，治疗骨质疏松势在必行。骨质疏松症是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构被破坏造成骨脆性增加、从而容易发生骨折的全身性骨病[1]。这种症状常常是由于骨吸收和转化的不平衡造成的。现如今国内外已经出现许多用于骨质疏松症患者缓解康复的药物例如一些双磷酸盐类，它能有效抑制破骨细胞活性、降低骨转换。还有一些降钙素类药物，它可以抑制破骨细胞生物活性和减少破骨细胞数量，可预防骨量丢失并增加骨量[2]。但这些药物存在着一些共同不足就是抗骨吸收的效果时常会高于促进骨形成的效果。因此开发具有抑制骨吸收和促进骨形成双重效果[3]的抗骨质疏松药物尤为重要。文献综述

目前，作为最新一代抗骨质疏松的药物雷奈酸锶（Sr）已经被证实了具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）向成骨细胞方向分化的作用。该作用的机理是Sr能够通过细胞外信号调节激酶激活Ras/ MA- PK（有丝分裂原蛋白活化激酶）信号通路及下游成骨细胞特异性转录因子Runx-2的活性来促进骨髓间充质干细胞向成骨分化[4]。本文则是引入了Rho激酶抑制剂对rBMSCs信号通路的影响来进一步探究该抑制剂对于在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中是否具有促进或抑制rBMSCs增殖和分裂作用。Rho激酶（ROCK）是Rho蛋白下游效应分子之一，作为Se/Thr（丝氨酸/苏氨酸）蛋白激酶家族成员，ROCK活化后可以介导其下游一系列底物磷酸化/脱磷酸化反应[5]，同时在细胞迁移、增殖和凋亡等多种细胞生命活动中具有重要的细胞内信号转导作用。